教學(xué)目標(biāo)：1、概述植物組織培養(yǎng)和植物體細(xì)胞雜交技術(shù)的原理和過程。2、舉例說明植物細(xì)胞工程的應(yīng)用有效提高了生產(chǎn)效率。3、嘗試進(jìn)行植物組織培養(yǎng)。教學(xué)重點(diǎn)：1、植物組織培養(yǎng)的原理和過程。2、植物體細(xì)胞雜交技術(shù)的原理。3、植物細(xì)胞工程應(yīng)用的實(shí)例。教學(xué)難點(diǎn)：植物組織培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞工程是指應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)等多學(xué)科的原理和方法，通過細(xì)胞器、細(xì)胞或組織水平上的操作，有目的地獲得細(xì)胞、組織、器官、個(gè)體或其產(chǎn)品的一門綜合性的生物工程。動(dòng)物細(xì)胞工程植物細(xì)胞工程原理操作水平目的植物組織培養(yǎng)植物體細(xì)胞雜交細(xì)胞工程的概述1902年，哈伯蘭特（G.

Haberlandt，1854-1945）提出了細(xì)胞全能性的理論，但相關(guān)實(shí)驗(yàn)嘗試沒有成功。1958年，斯圖爾特（F.

G.

Steward，1904-1993）等發(fā)現(xiàn)胡蘿卜的體細(xì)胞可以分化為胚，為細(xì)胞全能性理論提供了強(qiáng)有力的支持。1960年，科金（E.

C.

Cocking，1931-）用真菌的纖維素酶分解番茄根的細(xì)胞壁，成功獲得了原生質(zhì)體。1964年，古哈（S.

Guha，1938-2007）等在培養(yǎng)毛曼陀羅的花藥時(shí)，首次得到了由花藥中的花粉發(fā)育而成的胚。植物細(xì)胞工程動(dòng)物細(xì)胞工程（含胚胎工程）1971年，卡爾森（P.S.

Carlson，1944-2017）誘導(dǎo)煙草種間原生質(zhì)體融合，獲得種間雜種。1974年，土壤農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒被發(fā)現(xiàn)。1890年，希普（W.

Heape，1855-1929）將安哥拉兔的胚胎移入比利時(shí)兔的輸卵管內(nèi)，得到了兩只安哥拉兔，這是世界上胚胎移植成功的首例。1907年，哈里森（R.

G.Harrion，1870-1959）用一滴淋巴液成功培養(yǎng)了蝌蚪的神經(jīng)元，首創(chuàng)了動(dòng)物組織體外培養(yǎng)法。1951年，張明覺（1908-1991）等發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物精子的獲能現(xiàn)象。1958年，格登（J.Gurdon，1933-）用非洲爪蟾進(jìn)行體細(xì)胞核移植，成功培育出性成熟個(gè)體。同一時(shí)期，童弟周（1902-1979）等開展了魚類細(xì)胞核移植工作。1959年試管兔誕生，之后多種試管動(dòng)物相繼出生。1975年，米爾斯坦（C.Milstein，1927-2002）和科勒（G.

K?hler，1946-1995）等創(chuàng)立了單克隆抗體技術(shù)。1978年，小鼠桑葚胚被成功分割。次年，科學(xué)家分割綿羊胚胎獲得了同卵羔羊。1981年，埃文斯（M.J.Evans，1941-）等成功分離和培養(yǎng)小鼠的胚胎干細(xì)胞。1996年，世界上第一只細(xì)胞克隆羊多莉在英國(guó)誕生。隨后多種克隆動(dòng)物相繼問世。2006年，山中伸彌（S.Yamanaka，1962-）等獲得了誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。我國(guó)科學(xué)家利用這種細(xì)胞培育出了小鼠。2014年，世界上第一個(gè)用單細(xì)胞基因組測(cè)序進(jìn)行遺傳病篩查的試管嬰兒在我國(guó)誕生。2017年，我國(guó)科學(xué)家首次培育出體細(xì)胞克隆猴。植物細(xì)胞工程動(dòng)物細(xì)胞工程（含胚胎工程）第2章細(xì)胞工程第1節(jié)植物細(xì)胞工程從社會(huì)中來

“其茅葺，其葉青青，猶綠衣郎，挺節(jié)獨(dú)立，可敬可慕。迨（dài）夫花開，凝情瀼露，萬態(tài)千妍，薰風(fēng)自來，四坐芬郁，豈非真蘭室乎！豈非有國(guó)香乎！”

——《金漳蘭譜》一、植物細(xì)胞工程的基本技術(shù)植物細(xì)胞具有全能性細(xì)胞經(jīng)過分裂和分化后，仍然具有產(chǎn)生完整生物體或分化成其他各種細(xì)胞的潛能，即細(xì)胞具有全能性。1、定義2、原因

高度分化的細(xì)胞仍含有該物種的全部遺傳信息葉子花瓣花粉細(xì)胞植物體理論基礎(chǔ)3、細(xì)胞全能性大小的分析體細(xì)胞全能性與細(xì)胞分化程度體細(xì)胞全能性與細(xì)胞分裂能力不同類型細(xì)胞的全能性不同生物細(xì)胞的全能性分化程度低的＞分化程度高的分裂能力強(qiáng)的＞分裂能力弱的受精卵＞生殖細(xì)胞＞體細(xì)胞受精卵＞干細(xì)胞＞體細(xì)胞植物細(xì)胞＞動(dòng)物細(xì)胞4、植物體上的細(xì)胞不表現(xiàn)全能性的原因：在特定的時(shí)間和空間條件下，細(xì)胞中的基因會(huì)選擇性表達(dá)——如何才能讓細(xì)胞表現(xiàn)出全能性？1958年Steward利用胡蘿卜韌皮部誘導(dǎo)分化產(chǎn)生了胚狀體，這是人類第一次獲得了人工胚狀體，并獲得個(gè)體植株。5、植物細(xì)胞表現(xiàn)出全能性的條件：①離體②一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、植物激素③適宜的溫度、pH等外界條件（必修一

P118-121）④無菌環(huán)境

將離體的植物器官、組織或細(xì)胞等，培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，給予適宜的培養(yǎng)條件，誘導(dǎo)其形成完整植株的技術(shù)。（一）植物組織培養(yǎng)技術(shù)1、定義：2、原理：

植物細(xì)胞的全能性接種外植體誘導(dǎo)愈傷組織誘導(dǎo)生芽誘導(dǎo)生根移栽成活脫分化再分化脫分化：已分化細(xì)胞，失去其特有結(jié)構(gòu)和功能而轉(zhuǎn)變成未分化的細(xì)胞的過程。愈傷組織：不定形的薄壁組織團(tuán)塊再分化：愈傷組織在培養(yǎng)過程中重新分化根或芽等器官的過程。接種外植體誘導(dǎo)愈傷組織誘導(dǎo)生芽誘導(dǎo)生根移栽成活3、過程：外植體：離體培養(yǎng)的植物器官、組織或細(xì)胞植物組織培養(yǎng)常用的培養(yǎng)基配方

P116⑴培養(yǎng)基名稱：

；⑵物理性質(zhì)：

；⑶碳源：

。包括無機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分(水和無機(jī)鹽)、有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分(蔗糖、氨基酸、維生素等)、特定濃度和比例的激素(主要是生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素)；蔗糖的作用：作為碳源，提供能量，調(diào)節(jié)滲透壓注：1、MS培養(yǎng)基（固體培養(yǎng)基）——P116蔗糖：碳源，提供能量，調(diào)節(jié)滲透壓2、植物激素的作用：生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素是啟動(dòng)細(xì)胞分裂、脫分化和再分化的關(guān)鍵激素。生長(zhǎng)素用量/細(xì)胞分裂素用量結(jié)果比值≈1比值＞1比值＜1促進(jìn)根的分化促進(jìn)芽的分化促進(jìn)愈傷組織的形成巧記：高根低芽中愈傷菊花的組織培養(yǎng)思考·討論4、方法步驟：①外植體消毒②外植體切段③接種外植體④誘導(dǎo)愈傷組織⑤誘導(dǎo)芽和根⑥移栽①外植體消毒用酒精擦拭雙手和超凈工作臺(tái)面流水沖洗外植體(幼嫩的莖段)酒精消毒30s無菌水清洗2~3次次氯酸鈣溶液處理30min無菌水清洗2~3次②外植體切段消毒過的外植體置于無菌培養(yǎng)皿用無菌濾紙吸去表面水分用解剖刀將外植體切成0.5~1cm長(zhǎng)的小段③接種外植體在酒精燈火焰旁，將外植體的1/3~1/2插入誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基中。用封口膜或瓶蓋封蓋瓶口，并在培養(yǎng)瓶上做好標(biāo)記。接種時(shí)注意外植體的方向，不要倒插。接種操作必須在酒精燈火焰旁進(jìn)行。每次使用后的器械都要滅菌。④誘導(dǎo)愈傷組織誘導(dǎo)愈傷組織一般不需要光照。將接種了外植體的錐形瓶置于18~22℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，定期觀察和記錄愈傷組織的生長(zhǎng)情況。誘導(dǎo)芽和根期間需要給予適當(dāng)時(shí)間和強(qiáng)度的光照培養(yǎng)15~20d后，將生長(zhǎng)良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接到生芽培養(yǎng)基上長(zhǎng)出芽后，再將其轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)生根的培養(yǎng)基上⑤誘導(dǎo)芽和根進(jìn)一步誘導(dǎo)形成試管苗⑥移栽打開封口膜，讓試管苗在培養(yǎng)箱內(nèi)生長(zhǎng)幾日。用流水清洗掉根部的培養(yǎng)基將幼苗移植到消毒的蛭石或珍珠巖等環(huán)境中，待其長(zhǎng)壯后再移栽入土。每天觀察并記錄生長(zhǎng)情況。適時(shí)澆水、施肥，直至開花①接種3~4d后，檢查外植體的生長(zhǎng)情況，統(tǒng)計(jì)有多少外植體被污染，試分析它們被污染的可能原因。培養(yǎng)基、接種工具滅菌不徹底；外植體消毒不徹底；操作過程不符合無菌操作要求等。

被污染的培養(yǎng)基②為什么要進(jìn)行一系列的消毒，滅菌，并且要求無菌操作？原因是避免雜菌在上面迅速生長(zhǎng)消耗營(yíng)養(yǎng)，且有些雜菌會(huì)危害培養(yǎng)物生長(zhǎng)。③雜菌和植物細(xì)胞之間有哪些關(guān)系？競(jìng)爭(zhēng)或寄生。結(jié)果分析與評(píng)價(jià)拓展：植物組織培養(yǎng)的兩種途徑胚狀體：離體培養(yǎng)條件下，沒有經(jīng)過受精過程，但經(jīng)過胚胎發(fā)育過程形成的胚狀類似物，因而統(tǒng)稱為體細(xì)胞胚或胚狀體。胚狀體途徑器官發(fā)生途徑外植體脫分化愈傷組織再分化生芽生根或胚狀體生長(zhǎng)發(fā)育試管苗（移栽到大田）西紅柿土豆×從社會(huì)中來1.通過有性雜交能實(shí)現(xiàn)嗎？為什么？不能，不同種物種間存在生殖隔離植物體細(xì)胞雜交技術(shù)2.有沒有方法可以打破生殖隔離，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交育種，獲得“番茄-馬鈴薯雜種植株”呢？（二）植物體細(xì)胞雜交技術(shù)1、概念：將不同來源的植物體細(xì)胞，在一定條件下融合成雜種細(xì)胞，并把雜種細(xì)胞培育成新植物體的技術(shù)。2、原理：細(xì)胞膜的流動(dòng)性和植物細(xì)胞的全能性A細(xì)胞B細(xì)胞纖維素酶果膠酶去壁酶解法正在融合的原生質(zhì)體雜種細(xì)胞AB誘融物理法：化學(xué)法：電融合法、離心法等聚乙二醇（PEG）融合法等脫分化再分化移栽植物細(xì)胞融合植物組織培養(yǎng)雜種植株愈傷組織A原生質(zhì)體B原生質(zhì)體移栽后的植株去壁植物細(xì)胞融合完成的標(biāo)志植物體細(xì)胞雜交完成的標(biāo)志3、過程：（植物細(xì)胞的全能性）（細(xì)胞膜的流動(dòng)性）再生細(xì)胞壁4、意義：打破生殖隔離，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)源雜交育種注：1、兩個(gè)標(biāo)志：①融合完成的標(biāo)志②體細(xì)胞雜交完成的標(biāo)志——再生新的細(xì)胞壁（與高爾基體等有關(guān)）——培育出雜種植株2、體細(xì)胞融合后，培養(yǎng)基中共有5種類型細(xì)胞：A，B，AA，BB，AB3、雜種細(xì)胞中染色體數(shù)、染色體組數(shù)，都采用直接相加A為2N=20