基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)第1頁/共36頁內(nèi)容提要一、基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法細(xì)胞培養(yǎng)MTT劃痕修復(fù)westernblotsiRNA二、如何把實(shí)驗(yàn)做好（心得體會）第2頁/共36頁一、基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法（一）細(xì)胞培養(yǎng)1培養(yǎng)細(xì)胞的特性培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式

貼附生長：貼附于支持物表面懸浮生長：于懸浮狀態(tài)下即可生長第3頁/共36頁游離期貼壁期第4頁/共36頁第5頁/共36頁潛伏期對數(shù)生長期停止期（平臺期）

第6頁/共36頁培養(yǎng)細(xì)胞生長的條件1細(xì)胞的營養(yǎng)需要（血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵）2細(xì)胞的生存環(huán)境溫度:37℃O220%

CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-pH:7.2-7.4

滲透壓

3無污染

4無毒第7頁/共36頁2.四唑鹽（MTT）比色法原理：（1）活細(xì)胞線粒體脫氫酶（2）可溶性的四唑鹽還原成不溶于水的藍(lán)紫色產(chǎn)物（formazan)，沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒有這種功能。第8頁/共36頁預(yù)實(shí)驗(yàn)OD:0.8—1.2有效值（線性范圍）吸光度與所含的formazan量成正比細(xì)胞點(diǎn)板量的確定（保證所測的con值在0.8-1.2之間）不同的細(xì)胞株不同不同的時間點(diǎn)不同第9頁/共36頁每孔細(xì)胞量24h48h30000.40.550000.60.780000.80.91000011120001.11.1150001.21.2200001.31.4第10頁/共36頁細(xì)胞計數(shù)×104個/ml每孔點(diǎn)板100μl給藥100μl第11頁/共36頁操作步驟（1）單細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板；8000個細(xì)胞/孔，每孔培養(yǎng)基總量200微升（100+100），37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間（根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臎Q定培養(yǎng)時間）（2）加入2毫克／毫升的MTT液（20微升／孔）；繼續(xù)培養(yǎng)3小時。（3）吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO液（100微升／孔），將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩10分鐘，使結(jié)晶物溶解。（4）酶標(biāo)儀檢測各孔OD值（檢測波長570nM）。記錄結(jié)果，繪制第12頁/共36頁點(diǎn)板注意事項(xiàng)蛇行點(diǎn)板十字交叉給藥方向點(diǎn)板方向第13頁/共36頁直接比較各組OD值計算抑制率，公式[（對照-本底）-（給藥-本底）]/（對照-本底）*100%.第14頁/共36頁3.劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)（woundhealing）原理：腫瘤細(xì)胞運(yùn)動特性之一：側(cè)向遷移能力借鑒體外細(xì)胞至傷愈合模型，在體外培養(yǎng)的單層細(xì)胞上，劃痕致傷，然后觀察處理后細(xì)胞遷移的能力0h24hCon(10%血清)給藥第15頁/共36頁實(shí)驗(yàn)步驟1.細(xì)胞點(diǎn)板，具體數(shù)量因細(xì)胞不同而不同，并根據(jù)給藥時間和條件來定。2.第二天用槍頭比著直尺，盡量垂直于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不要傾斜。3.用PBS洗細(xì)胞3次，去除劃落的細(xì)胞，加入培養(yǎng)基。4.放入37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。按0、6、12、24小時取樣，拍照。第16頁/共36頁實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)劃痕質(zhì)量寬度筆直程度劃痕后一定要清洗干凈第17頁/共36頁結(jié)果處理Part1Part2第18頁/共36頁4.Westernblot原理：

經(jīng)過電泳分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體抗原抗體反應(yīng)

先分離后分析蛋白含量或者表達(dá)、存在形式的變化第19頁/共36頁蛋白樣品的制備SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)膜封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色實(shí)驗(yàn)步驟第20頁/共36頁實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)1.上樣量蛋白KD數(shù)2.制膠：上層膠和下層膠的比例上層膠不能有碎膠泳道筆直3.加樣前樣品應(yīng)先離心,尤其是長時間放置的樣品,以減少蛋白質(zhì)帶的拖尾現(xiàn)象4.轉(zhuǎn)膜：成功的關(guān)鍵保證時間不同厚度的膠最好不要一起轉(zhuǎn)第21頁/共36頁5.合適一抗?jié)舛鹊停簺]有條帶或條帶不清晰高：非特異性結(jié)合雜帶6.樣品緩沖液中煮沸的樣品可在-20℃存放數(shù)月,但是反復(fù)凍融會使蛋白質(zhì)降解第22頁/共36頁5.siRNA原理dsRNA的剪切RISC的形成siRNA介導(dǎo)的RISC對mRNA的剪切作用第23頁/共36頁RISC（RNA-inducedsilencingcomplex）第24頁/共36頁選擇、設(shè)計、合成siRNA雙鏈（5種）化學(xué)合成siRNA質(zhì)粒表達(dá)siRNA轉(zhuǎn)染siRNA到靶細(xì)胞瞬時表達(dá)——化學(xué)合成siRNA，質(zhì)粒表達(dá)siRNA穩(wěn)定表達(dá)——質(zhì)粒表達(dá)siRNA分析檢測RNA干擾作用蛋白水平:WB/IF/FCmRNA水平:RT-PCR、northernblottingsiRNA基因沉默實(shí)驗(yàn)設(shè)計第25頁/共36頁siRNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀DEAE-葡聚糖和polybrene電穿孔法機(jī)械法陽離子脂質(zhì)體試劑陽離子聚合物病毒介導(dǎo)法第26頁/共36頁DNAorsiRNA:highlyanionicandhydrophilicmacromoleculeNoionicinteraction++++++++++Cationicmacromolecule++++++CationicReagentMembrane:anionicandhydrophobic----------第27頁/共36頁siRNA轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000（Invitrogen）INTERFERin?（Polyplus）Oligofectamine（Invitrogen）HiPerFect（Qiagen）SiLentFect（BioRad）第28頁/共36頁轉(zhuǎn)染的檢測

蛋白水平檢測:WB/IF/FCmRNA水平檢測:RT-PCR、northernblotting第29頁/共36頁步驟第30頁/共36頁第31頁/共36頁第32頁/共36頁第33頁/共36頁注意事項(xiàng)避免RNA酶污染細(xì)胞狀態(tài)培養(yǎng)基和嚴(yán)格的操作確保轉(zhuǎn)染的重復(fù)性避免使用抗生素根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑對細(xì)胞的毒性調(diào)整轉(zhuǎn)染時間