基因工程第四章工具酶第一頁，共三十四頁，2022年，8月28日RestrictionEndonucleaseSectionone第二頁，共三十四頁，2022年，8月28日核酸酶：指通過切割相鄰的兩個核苷酸之間的3－5磷酸二酯鍵，而引發(fā)核酸分子發(fā)生水解斷裂的酶。按水解斷裂核酸分子的方式不同，分為核酸內(nèi)切酶和外切酶。核酸外切酶：從核酸分子的末端開始，一個核苷酸，一個核苷酸地消化降解多核苷酸的酶。核酸內(nèi)切酶：從核酸分子的內(nèi)部，切割磷酸二酯鍵使之斷裂并形成小分子片斷的酶。限制性內(nèi)切酶是核酸內(nèi)切酶的一種。第三頁，共三十四頁，2022年，8月28日

ThetwodifferenttypesofexonucleaseItremovesnucleotidefrombothstrandsofDNAItremovesnucleotideonlyfromthe3’terminus第四頁，共三十四頁，2022年，8月28日一、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)與種類：1、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)：

20世紀60年代在研究細菌的限制和修飾現(xiàn)象時被Linn和Arber發(fā)現(xiàn)，他們研究的是大腸桿菌。大腸桿菌細胞可以降解噬菌體的DNA入侵，也就是在生物體可識別外源DNA，并將其降解，而保護自身的DNA不被感染。W.Arber第五頁，共三十四頁，2022年，8月28日這就是在生物體內(nèi)普遍存在的限制修飾現(xiàn)象。限制是restriction,修飾modification,所以書上把這一系統(tǒng)叫做：R/M體系。限制與修飾是由兩種酶引起的，一種是甲基轉移酶，一種是核酸內(nèi)切酶。核酸有四個堿基，堿基排列有44個排列順序，內(nèi)切酶具有識別位點，他的限制性體現(xiàn)在可以識別這些位點，并進行切割，這樣外源的DNA即使進入生物細胞，也可以被降解，這就是限制;修飾是由甲基化酶來完成的。在生物內(nèi)部有甲基化酶，他們可以催化甲基從給體分子S－酰苷甲硫氨酸轉移給可識別的序列（內(nèi)切酶），使之甲基化，這樣內(nèi)切酶無法識別甲基化的序列，就不能進行切割，從而保全了自身的DNA。第六頁，共三十四頁，2022年，8月28日限制與修飾存在兩方面的作用：一是保護自身的DNA不受限制，即不被切割；二是破壞外源DNA使之迅速降解。如果沒有限制修飾，DNA、基因到處都是，順利進入任何生物,改變遺傳物質(zhì)，發(fā)生變異。第七頁，共三十四頁，2022年，8月28日2.限制性內(nèi)切酶的種類：有三種不同類型：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型Ⅰ型、Ⅲ型在同一蛋白分子中兼有內(nèi)切和甲基化活性并且其依賴ATP，作用時吸收能量。第八頁，共三十四頁，2022年，8月28日Ⅱ型：其內(nèi)切酶活性和甲基化活性是分開的，只負責限制，因此叫限制性內(nèi)切酶。修飾由獨立的甲基酶完成。而且核酸內(nèi)切作用具有序列的特異性，可識別回文序列，－AGCT-，便于操作，廣泛應用。特點：識別特定的核苷酸序列，其長度為4--6個堿基，甚至8個，少數(shù)酶識別更長的序列。特定的序列：又叫識別序列或識別位點。這些序列的一個共同特點是具有雙重螺旋對稱的結構形式，可以進行180度的旋轉，呈回文結構。第九頁，共三十四頁，2022年，8月28日限制性內(nèi)切酶在識別序列后，對雙鏈DNA進行切割，雙鏈鍛裂后，形成特定的酶切末端，叫“粘性末端”。粘性末端有三種形式：

5”突出粘端：EcoRI切點

5---GAATTC---33---CTTAAG---5

3”突出粘端：PstI切割位點

5---CTGCAG---33---GACGTC---5第十頁，共三十四頁，2022年，8月28日平端：SmaI切割位點

5---CCCGGG---33---GGGCCC---5第十一頁，共三十四頁，2022年，8月28日二、限制性片斷末端的連接作用:DNA片斷經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后，可自然的重新連接起來，或環(huán)化起來；

不同DNA片斷通過互不的粘性末端之間的堿基配對而彼此相連接，稱之為分子間連接。同一DNA片斷通過互不的粘性末端的堿基配對連接成環(huán)狀形分子，稱為分子內(nèi)連接。對重新連接的DNA片斷經(jīng)加熱處理后，會重新線性化；如果對連接或環(huán)化的分子用連接酶處理，形成的DNA分子就是永久性的。第十二頁，共三十四頁，2022年，8月28日限制性內(nèi)切酶識別的靶序列同DNA的來源無關，也就是說不帶有種的特異性，對各種DNA都普遍適用。無論那種生物的DNA經(jīng)同一種酶作用切割后，形成的片斷都能連接再一起，來實現(xiàn)DNA重組。第十三頁，共三十四頁，2022年，8月28日三、限制性內(nèi)切酶的命名:1973年，Smith和Nathans提出了一個較系統(tǒng)的命名原則：Hin

d

III

Haemphilusinfluenzae嗜血流桿菌D菌株第三個酶Eco

R

I

Escherichiacoli

大腸桿菌R菌株第一個酶第十四頁，共三十四頁，2022年，8月28日四、影響酶活性的因素：1、靶DNA的純度：內(nèi)切酶的消化底物的速率很大程度上取決于使用的DNA樣品本身的純度。通常我們從生物樣品中提取出的DNA容液中，含有許多物質(zhì)，如蛋白質(zhì)，多糖，酚、氯仿，酒精、乙二胺四乙酸（EDTA）,SDS（十二烷基磺酸納），高濃度的鹽離子。這些都是酶活性的鈍化劑。酚的影響最大，他可以使蛋白質(zhì)變性，使酶失活。第十五頁，共三十四頁，2022年，8月28日消除辦法：

盡量保證DNA純度達到最大。酚抽提去蛋白；醇抽提（氯仿、異戊醇的抽提）去酚，去多糖；乙醇抽提去多元醇；沉淀（蛋白也沉，但DNA和蛋白能看的出來）；干燥去乙醇。增加酶的用量，平均每ug底物DNA的用量可達10個單位或更多。但有一個問題：商品化的酶均加入50％的甘油作為保護劑，在－20度保藏不會結凍。如果加入酶量過大，甘油濃度過高，會抑制酶活性。

擴大酶切反映的(體積)體系,使?jié)撛诘囊种埔蛩乇幌鄳南♂?。延長酶反映時間?？汕?4小時。

第十六頁，共三十四頁，2022年，8月28日2、DNA的甲基化程度：核酸內(nèi)切酶是原核生物限制修飾的組成部分，因此，識別序列中特定核苷酸的甲基化作用，會強烈的影響酶的活性，造成DNA只能被局部消化。為了避免這種問題，在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大腸桿菌菌株來制備質(zhì)粒DNA。第十七頁，共三十四頁，2022年，8月28日3、酶切溫度：DNA消化反應的溫度是影響核酸內(nèi)切酶活性的另一個重要的因素。不同內(nèi)切酶具有不同的最適反應溫度，大多數(shù)酶的反映溫度在37℃，消化時溫度低于或高于最適溫度，都會影響酶的活性，比如溫度低切割時之產(chǎn)生切口，而不能切斷DNA。第十八頁，共三十四頁，2022年，8月28日4.DNA的分子結構：DNA分子的結構有很多種，以質(zhì)粒DNA為例，他有三種存在方式，超螺旋、環(huán)狀帶切刻、線性。往往切割超螺旋時用的酶量要比消化線性DNA的量高出許多倍，甚至20倍。第十九頁，共三十四頁，2022年，8月28日5、內(nèi)切酶對不同部位的切割位點，其切割效率有著明顯的差別。這主要是由于切割位點的側翼序列存在著差異的結果（通常切割效率的差異不會超過10倍）。第二十頁，共三十四頁，2022年，8月28日6、內(nèi)切酶的緩沖液：不同的酶使用不同的類型Buffer鹽：Mgcl,Nacl,Kcl提供離子環(huán)境。酶的活性需要2價陽離子，“Mg”是最普遍的酶激活劑。

Tris-Hcl:緩沖液，他可以創(chuàng)造出pH是7.4的緩沖環(huán)境，保護酶分子，維持體系pH恒定。

β－巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）:巰基試劑對于保護某些核酸限制性內(nèi)切酶的結構穩(wěn)定性起著很大作用，防止其失活變性。有效防止二硫鍵形成。

BSA：牛血清白蛋白，酶的穩(wěn)定性。第二十一頁，共三十四頁，2022年，8月28日7.非適宜環(huán)境包括：非適宜環(huán)境包括：高濃度的內(nèi)切酶（酶專一性變化，產(chǎn)生無度切割，一個位點本來不能切割，但切割了，又叫Star活性變化），高濃度的甘油，低離子強度，Mg被Mn取代，高pH。8、酶切時間：通常酶切時間1－2小時，但大多數(shù)酶的活性可維持很長時間，我們可以酶切過夜。第二十二頁，共三十四頁，2022年，8月28日五、雙酶切：沒有不同的buffer:A/B/H/M/K.注意選擇兩個酶通用的緩沖液第二十三頁，共三十四頁，2022年，8月28日LigasesSectiontwo第二十四頁，共三十四頁，2022年，8月28日DNA連接酶：DNA被限制性內(nèi)切酶消化后，單憑粘性末端是不能彼此牢固的連接在一起的，需要進行連接處理，這樣我們用到了DNA連接酶。1.概念：能夠催化在2條DNA鏈之間形成磷酸二脂鍵的酶。條件是需要一條鏈的3末端具有一個游離的羥基（－OH）,在另一條鏈的5端具有一個磷酸基團（－P），另外由于形成二脂鍵是一種吸能反映所以反應中要有ATP（動物）和NAD＋（原核生物，氧化型）作為能源。第二十五頁，共三十四頁，2022年，8月28日2.特性：DNA連接酶不能連接兩條單鏈DNA分子或環(huán)化的單鏈DNA分子，被連接的必須是雙螺旋DNA的一部分。連接酶的來源有兩種，一種是大腸桿菌染色體編碼的DNA連接酶；另一種是大腸桿菌T4噬菌編碼的叫T4連接酶，這種酶容易制備，直接從感染T4大腸桿菌的菌體中分離純化，而且他可以連接兩條平末端的DNA片斷第二十六頁，共三十四頁，2022年，8月28日DNA連接酶只能連接DNA雙螺旋骨架上的切刻，而不能連接封閉缺口。反應溫度：連接酶的最適反映溫度是37℃，但我們不能采用這個溫度？？？？比如由內(nèi)切酶EcoRI產(chǎn)生的粘性末端是－TTAA-，末端搭連后，作用力是由4個A-T堿基對維持，37度下，他們的作用并不牢靠。但溫度低末端連接慢。我們在實驗室操作中往往采用4－15℃比較合適，這個溫度是介于酶的作用速率和末端結合速率之間，一般認為4℃連接反應進行較慢。連接反應可以是4℃連接24小時，或15℃過夜（注意參照說明書）。第二十七頁，共三十四頁，2022年，8月28日DNA連接酶用法與用量：平末端DNA分子的連接最適反應的酶量為1－2個單位，粘末端的連接，酶量為0.1個單位較好。第二十八頁，共三十四頁，2022年，8月28日polymeraseSectionthree第二十九頁，共三十四頁，2022年，8月28日DNA聚合酶DNA聚合酶IKlenow大片段T4DNA聚合酶反轉錄酶Taq酶共同點：以一條DNA（RNA）為模板，通過聚合作用能夠把脫氧核糖核酸連續(xù)的加到引物鏈的3－OH末端。第三十頁，共三十四頁，2022年，8月28日一、DNA聚合酶I大腸桿菌的DNA聚合酶I是一條約1000個aa的多肽鏈形成的單亞基蛋白，分子量109x103Da.1.三種活性：聚合活性：將4種脫氧核糖核苷酸聚合為新的DNA鏈。

5----3外切酶活性:3----5外切酶活性：防止錯配。2.DNA聚合酶I催化合成DNA鏈的條件：四種核苷酸，游離的－OH

模板鏈第三十一頁，共三十四頁，2022年，8月28日3.作用：

DNA雜交的探針制備：依靠DNA聚合酶缺口平移。由于DNA聚合酶I具有5－3外切酶活性，切下后，聚合酶活性表現(xiàn)出來，又加上一個新的堿基可使切刻由5－3的方向移動，加上的dNTP用P標記，這樣換上的新鏈上就有了放射性標記。第三十二頁，共三十四頁，2022年，8月28日二、klenow片斷：用蛋白酶處理大腸桿菌DNA聚合酶I產(chǎn)生兩個片斷，一個片斷帶有5――3外切酶活性；一個片斷失去5