本章目錄HPLC講稿2015年5月by

laozhu本章目錄1

引言與分離類型2HPLC儀器3

固定相與流動(dòng)相4

柱效與色譜條件23.0HPLC的歷史與特點(diǎn)1引言與分離類型高效液相色譜法HPLCHighPerformanceLiquidChromatographyLC：流動(dòng)相是液體而已！從茨維特發(fā)明的方法到薄層爬板，都是液體流動(dòng)相。本章說(shuō)的HPLC小顆粒填料的柱色譜高柱效(n≈1萬(wàn)/m)高壓(泵)輸送流動(dòng)相快速可作制備色譜23.0HPLC的歷史與特點(diǎn)1引言與分離類型HPLC的特點(diǎn)GC與LC的比較應(yīng)用范圍寬！LC固定相粒度很小<10μm，分離效率很高LC流動(dòng)相選擇余地大：各種溶劑LC適合于高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、M大化合物GC限于低沸點(diǎn)、穩(wěn)定性好LC通常都是室溫操作討論：GC填充柱的粒徑？23.0HPLC的歷史與特點(diǎn)1引言與分離類型HPLC就要登場(chǎng)方法廣告先出！每個(gè)新方法都是更好的？高壓泵/儀器貴/溶劑純化嚴(yán)格/環(huán)境問(wèn)題LC的比較不足的HPLC的特點(diǎn)應(yīng)用范圍寬！第n臺(tái)儀器AgilentHPLC1200實(shí)驗(yàn)上機(jī)23.0HPLC的歷史與特點(diǎn)1引言與分離類型色譜相關(guān)分析法，分析化學(xué)3/43—4色譜法(按流動(dòng)相)液相色譜氣相色譜液相色譜HPLC特殊地位!23.0我的HPLC歷程1引言與分離類型1996龍燈公司在化學(xué)館6樓首次使用2000去某公司使用HPLC，神奇儀器2003化學(xué)系第一臺(tái)HPLC，Agilent

11002003.8用外卡去Agilent公司培訓(xùn)一周2004HPLC進(jìn)入課件科普版2013HPLC專業(yè)課主講，課時(shí)太少了HPLC我的一桶水！23.1HPLC的基本分離類型1引言與分離類型按分離機(jī)理分四大類液液分配l-lpartition液固吸附l-sadsorption離子ionexchange交換對(duì)凝膠滲透gelpermeation應(yīng)用最廣泛：(反相)鍵合相色譜（可以單獨(dú)列出）機(jī)理上本書偏向于吸附色譜，也有認(rèn)為分配色譜的！應(yīng)用最廣泛：bonded-phasechromatography(反相)鍵合相色譜（可以單獨(dú)列出）機(jī)理上本書偏向于吸附色譜，也有認(rèn)為分配色譜的！23.1HPLC的基本分離類型1引言與分離類型液液分配l-lpartition原理雷同于有機(jī)-水溶劑萃取固定液涂布在載體上現(xiàn)在被鍵合相色譜取代了液固吸附l-sadsorption茨維特的色譜/傳說(shuō)中的過(guò)柱子固定相：多孔硅膠微球保留：羧酸>酚/醇>醛酮>酯醚>烷離子ion

exchange交換對(duì)IEC：離子交換原理對(duì)象特殊：分析各種離子Ion-pairchromatography(IPC)

凝膠滲透gelpermeation排阻色譜，按分子大小分離，測(cè)分子量固定相：多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)

二乙烯基苯交聯(lián)聚苯乙烯流動(dòng)相：四氫呋喃，甲苯，…

本章目錄2HPLC儀器1

引言與分離類型3

固定相與流動(dòng)相4

柱效與色譜條件看流程23.2儀器基本模塊2高效液相色譜儀3/14/20237:34PM溶劑傳輸系統(tǒng)：心臟高壓泵

樣品引入系統(tǒng)：自動(dòng)化進(jìn)樣器

樣品分離系統(tǒng)：多種類色譜柱

信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)：UVD最普及檢測(cè)器

數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：操作系統(tǒng)軟件

餾分收集23.2.1高壓輸液系統(tǒng)2高效液相色譜儀3/14/20237:34PM傳輸系統(tǒng)相關(guān)部件高壓泵:最關(guān)注儲(chǔ)液罐脫氣機(jī)，過(guò)濾器梯度淋洗裝置傳輸系統(tǒng)相關(guān)部件高壓泵:最關(guān)注儲(chǔ)液罐脫氣機(jī)，過(guò)濾器梯度淋洗裝置23.2.1高壓輸液系統(tǒng)2高效液相色譜儀3/14/20237:34PM高壓泵:往復(fù)式活塞泵儲(chǔ)液罐理解單向閥原理彈簧隔板/紅寶石球23.2.1高壓輸液系統(tǒng)2高效液相色譜儀3/14/20237:34PM二元泵與四元泵不是４個(gè)泵／比例閥在工作/必配真空脫氣機(jī)二元泵各控制一種溶劑四元泵位置23.2.1高壓輸液系統(tǒng)2高效液相色譜儀3/14/20237:34PM脫氣機(jī)在真空室內(nèi)使用半透膜管路

TubularPlasticMembrane有效降低噪音半透膜管

透氣不漏液實(shí)驗(yàn)時(shí)，突突突，聽(tīng)到間隙工作3rd23.2.2進(jìn)樣系統(tǒng)-手動(dòng)2高效液相色譜儀3/14/20237:34PM手動(dòng)進(jìn)樣：和GC手動(dòng)的區(qū)別六通伐定量環(huán)確保20μL實(shí)際取50μL操作：扳一下伐，進(jìn)樣完成，出start信號(hào)23.2.2進(jìn)樣系統(tǒng)-自動(dòng)2高效液相色譜儀3/14/20237:34PM全機(jī)控取樣進(jìn)樣復(fù)位清洗公司產(chǎn)品介紹，單價(jià)1萬(wàn)USD，暫無(wú)(唯一無(wú)！)3rd23.2.3色譜柱2高效液相色譜儀可不配柱溫箱柱溫箱各種規(guī)格色譜柱L：5～50cm；ID：4.6

or

3.9、2.1

mm填料粒徑：1～10

μm，理論n=5000-10000/m制備色譜更大規(guī)格3rd23.2.4檢測(cè)器2高效液相色譜儀溶液中檢測(cè)紫外光度檢測(cè)器UVD示差折光檢測(cè)器RIDdifferentialrefractiveindexdetector熒光檢測(cè)器FLDFluorescenceDetector電化學(xué)檢測(cè)器ECD最普及最通用，實(shí)用于糖類靈敏度低，不可梯度靈敏度高，選擇性好進(jìn)行衍生化后測(cè)量…宜DIY電導(dǎo)/極譜…各自特點(diǎn)23.2.4檢測(cè)器2高效液相色譜儀紫外光度檢測(cè)器全波長(zhǎng)DAD價(jià)高/變波長(zhǎng)VWDDAD檢測(cè)器是這單元光路圖氘燈大部分場(chǎng)合是這類檢測(cè)器，選擇合適波長(zhǎng)儀器把吸光度值×1000，記錄為mAu，非規(guī)范單位3rd23.2.5軟件系統(tǒng)2高效液相色譜儀3/14/20237:34PM實(shí)踐中掌握各公司產(chǎn)品有差異從事這行的，幾乎整天在操作軟件本章目錄3固定相與流動(dòng)相1

引言與分離類型2HPLC儀器4

柱效與色譜條件23.3.0何為反相色譜ReversedPhase3

固定相與流動(dòng)相3/14/20237:34PM反相HPLC(主流)極性:固定相<流動(dòng)相固定相-非極性流動(dòng)相(水,甲醇,乙腈)-極性非極性物質(zhì)后出峰正相HPLC

極性:固定相>流動(dòng)相固定相-極性流動(dòng)相(己烷,庚烷)-非極性極性物質(zhì)后出峰正相色譜20%反相色譜80%正相色譜20%反相色譜80%不是把柱反接是流動(dòng)相極性更大傳統(tǒng)GC流動(dòng)相無(wú)極性23.3.1固定相(鍵合相色譜)3

固定相與流動(dòng)相3/14/20237:34PM多孔微粒硅膠基質(zhì)鍵合有機(jī)物C18最常用OctadecylsilanechemicallybondedtosilicagelODS柱=C18(18烷)柱

23.3.1固定相(鍵合相色譜)3

固定相與流動(dòng)相3/14/20237:34PM鍵合固定相的制備硅膠載體與硅烷化試劑反應(yīng)23.3.1固定相(鍵合相色譜)3

固定相與流動(dòng)相3/14/20237:34PM“刷子”或“尖樁籬笆”結(jié)構(gòu)頭發(fā)豎起趴下問(wèn)題！23.3.1固定相(鍵合相色譜)3

固定相與流動(dòng)相3/14/20237:34PM類型鍵合官能團(tuán)性質(zhì)色譜分離方式烷基C8非極性反相烷基C18非極性最弱反相苯基非極性反相芳硝基弱極性反相

/

正相氰基極性正相

/

反相氨基極性正相

/

反相常見(jiàn)鍵合相類型及色譜體系23.3.2流動(dòng)相3

固定相與流動(dòng)相3/14/20237:34PM對(duì)流動(dòng)相的要求：

①純度高，過(guò)濾除微塵，針式濾器還記得嗎？超純水，色譜級(jí)甲醇、乙腈②不用緩沖溶液對(duì)系統(tǒng)更好。如使用，則:

pH2～8，看規(guī)定，濃度<0.1mol/L，盡量小③對(duì)樣品適當(dāng)?shù)娜芙饽芰?，建議流動(dòng)相溶樣④粘度低一些，流動(dòng)性好，柱壓不高⑤考慮檢測(cè)器相匹配，化學(xué)穩(wěn)定性好…23.3.2流動(dòng)相3

固定相與流動(dòng)相3/14/20237:34PM反相色譜最常用乙腈、甲醇、水（緩沖溶液）通常是混合溶劑，采用梯度洗脫乙腈–水、甲醇-水（緩沖溶液）實(shí)驗(yàn)結(jié)束，洗滌后用有機(jī)相充滿柱23.3.2流動(dòng)相3

固定相與流動(dòng)相3/14/20237:34PM思考題（結(jié)合實(shí)驗(yàn)）：1）討論反相色譜中甲醇、水、乙腈洗脫能力的強(qiáng)弱。當(dāng)甲醇-水體系中甲醇比例從50%增加到70%是，待測(cè)物保留時(shí)間如何變化？2）加入pH緩沖溶液的目的是什么？本章目錄4

柱效與色譜條件1

引言與分離類型2HPLC儀器3固定相與流動(dòng)相23.4.1速率方程4

柱效及色譜條件3/14/20237:34PM流動(dòng)相是液體：組分的擴(kuò)散系數(shù)Dm在很小，1/105不可壓縮吉丁斯液相色譜速率方程：23.4.1速率方程4

柱效及色譜條件3/14/20237:34PM渦流擴(kuò)散項(xiàng)，dp在1-10μm不均勻因子λ為1-2在液相流動(dòng)相中，Dm在很小u大或者dp大時(shí)，B/u忽略三項(xiàng)依次與dp、df(膜厚)、dp平方正比與Dm、Ds、Dm成反比p490形象圖示峰展寬這項(xiàng)GC沒(méi)的：流動(dòng)相滯留在s相孔穴內(nèi)靜止，致傳質(zhì)阻力23.4.1速率方程4

柱效及色譜條件3/14/20237:34PM渦流擴(kuò)散與流動(dòng)相傳質(zhì)，最大影響因素均dp吉丁斯Giddings偶合方程偶合效應(yīng)關(guān)注到dp幾乎影響每一項(xiàng)，是重要因素！23.4.2色譜條件4

柱效及色譜條件3/14/20237:34PM不同填料粒度dp的柱效H關(guān)注到dp幾乎影響每一項(xiàng)，是重要因素！注意p491圖23-5b大顆粒不是重點(diǎn)23.4.2色譜條件4

柱效及色譜條件3/14/20237:34PM不同粒徑最優(yōu)uopt和Hminn:1.7μm顯著提高更短/允許流速快當(dāng)場(chǎng)測(cè)算分析時(shí)間1/10UPLC(ultraperformanceliquidchromatography)23.4.2色譜條件4柱效及色譜條件3/14/20237:34PM流動(dòng)相/是否要緩沖液填料粒徑固定相類型檢測(cè)波長(zhǎng)柱溫，…23.4.2色譜條件4柱效及色譜條件3/14/20237:34PM基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)——柱效檢測(cè)尿嘧啶、苯酚、甲苯、4-氯硝基苯柱的出廠報(bào)告就是這4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣做的尿嘧啶苯酚甲苯4-氯硝基苯23.4.2色譜條件4柱效及色譜條件3/14/20237:34PM苯基柱dp=5μm，ID=4.6mm，L=150mmAQ-C18柱dp=5μm，ID=4.6mm，L=150mm甲苯/對(duì)氯硝基苯峰位互換！氰基柱dp=5μm，ID=4.6mm，L=150mm柱子極性過(guò)大，出太快，沒(méi)分開(kāi)結(jié)論：ODS柱首選，不理想時(shí)再優(yōu)選其他柱23.4.2色譜條件4柱效及色譜條件3/14/20237:34PM水的比例高低，對(duì)分離什么影響70%甲醇30%水80%甲醇20%水90%甲醇10%水網(wǎng)絡(luò)交流考點(diǎn)23.4.2色譜條件4柱效及色譜條件3/14/20237:34PM是否要緩沖液實(shí)驗(yàn)中體會(huì)更多操作條件：檢測(cè)波長(zhǎng)柱溫，…色譜柱規(guī)格型號(hào)23.4.2色譜條件4柱效及色譜條件3/14/20237:34PM多動(dòng)手，多問(wèn)下周五實(shí)驗(yàn)開(kāi)始：