單鏈內(nèi)切核酸酶第1頁(yè)/共19頁(yè)2023/3/222本節(jié)重點(diǎn)：1.S1核酸酶的活性和應(yīng)用。2.Bal31核酸酶的活性和應(yīng)用。3.脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ)的活性和應(yīng)用。第2頁(yè)/共19頁(yè)2023/3/223一、S1核酸酶

S1核酸酶來(lái)源于米曲霉菌，是一種含鋅的蛋白質(zhì)，相對(duì)分子質(zhì)量為32000，相對(duì)耐熱，由nucO編碼，該基因已被克隆。S1核酸酶是一種高度單鏈特異性的內(nèi)切核酸酶，催化反應(yīng)需要Zn2+和酸性條件，最佳pH4.0~4.5。第3頁(yè)/共19頁(yè)2023/3/224

S1核酸酶的特性：

（1）在高離子強(qiáng)度、pH4.2和1mmol/LZn2+存在的條件下，S1核酸酶可以高特異性地降解單鏈DNA和RNA，包括雙鏈分子中的單鏈區(qū)域（如發(fā)卡結(jié)構(gòu)），反應(yīng)產(chǎn)物為5'單核苷酸。第4頁(yè)/共19頁(yè)2023/3/225（2）調(diào)節(jié)S1核酸酶的用量，可以切割雙鏈DNA的單鏈缺刻，但不能識(shí)別單個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)配。（3）當(dāng)S1核酸酶用量過(guò)大時(shí)，伴有雙鏈核酸的降解，但該酶降解單鏈DNA的速度是降解雙鏈DNA的75000倍。第5頁(yè)/共19頁(yè)2023/3/226第6頁(yè)/共19頁(yè)2023/3/227S1核酸酶的應(yīng)用：（1）可用于切掉DNA片段的單鏈突出末端以產(chǎn)生平末端；（2）打開(kāi)雙鏈cDNA合成中的發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)；（3）S1核酸酶作圖法在測(cè)定雜交核酸分子的雜交程度、RNA分子定位、確定內(nèi)含子的位置、內(nèi)含子和外顯子剪切位點(diǎn)的定位、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與終止位點(diǎn)的測(cè)定中，S1核酸酶都是十分有效的工具。第7頁(yè)/共19頁(yè)2023/3/228

S1核酸酶的活性可被PO43-、5'核苷、核苷三磷酸、枸櫞酸鹽和EDTA抑制。然而，其在低溶度的變性劑（如SDS、尿素甲酰胺）存在的條件下穩(wěn)定。第8頁(yè)/共19頁(yè)2023/3/229

二、Bal31核酸酶

Bal31核酸酶的特性：

對(duì)單鏈DNA具有特異的內(nèi)切酶活性，可從3'-OH末端迅速降解DNA。對(duì)于線性雙鏈DNA分子，它表現(xiàn)為3'→5'端的外切酶活性和5'→3'的外切酶活性，可有控制地從3'末端和5'末端逐個(gè)水解除去單核苷酸，產(chǎn)生縮短了的DNA分子。（注意：Bal31的3'外切酶活性約為它的單鏈特異性?xún)?nèi)切酶活性的20倍）第9頁(yè)/共19頁(yè)2023/3/2210

當(dāng)?shù)孜锸请p鏈環(huán)形的DNA分子時(shí)，Bal31的單鏈特異性?xún)?nèi)切核酸酶活性，通過(guò)對(duì)單鏈缺口或瞬時(shí)單鏈區(qū)的降解作用，將超螺旋的DNA切割成開(kāi)環(huán)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而成為線性雙鏈DNA分子。除此以外，Bal31核酸酶還可起到核糖核酸酶的作用，催化核糖體和tRNA的降解，但它不具有雙鏈特異的核酸外切酶活性。第10頁(yè)/共19頁(yè)2023/3/2211第11頁(yè)/共19頁(yè)2023/3/2212

Bal31核酸酶的應(yīng)用：

Bal31核酸酶降解DNA需要Ca2+的存在，在反應(yīng)的不同階段加入螯合劑—EGTA（乙二醇雙β－氨基乙醚四乙酸）可使反應(yīng)終止。（1）用于確定DNA片段的限制酶圖譜使用Bal31核酸酶降解待測(cè)DNA，在不同反應(yīng)時(shí)間取出反應(yīng)物，用EGTA溶液中止反應(yīng)。然后，各樣品用相應(yīng)限制性?xún)?nèi)切核酸酶消化后，可看到酶切片段按一定的順序消失。

第12頁(yè)/共19頁(yè)2023/3/2213限制酶圖譜就是一系列限制酶的特異識(shí)別序列在DNA鏈上的出現(xiàn)頻率和它們之間的相對(duì)位置。它實(shí)際上就是限制酶的特異切點(diǎn)在DNA上的定位，表現(xiàn)出一些部位的線性序列，它是DNA分子結(jié)構(gòu)特異性的反映，所以限制酶圖譜又稱(chēng)DNA的物理圖譜。第13頁(yè)/共19頁(yè)2023/3/2214（2）可用于在克隆前通過(guò)可控方式去除雙鏈DNA末端不需要的序列。處理后的DNA末端，可用T4噬菌體DNA聚合酶或大腸桿菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段補(bǔ)平，再加入合成接頭，插入適當(dāng)載體。用此方法，還可以在DNA上生成一系列終點(diǎn)確定的缺失突變體。（3）用于確定DNA分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)第14頁(yè)/共19頁(yè)2023/3/2215第15頁(yè)/共19頁(yè)2023/3/2216三、脫氧核糖核酸酶Ⅰ

脫氧核糖核酸酶Ⅰ簡(jiǎn)稱(chēng)DNA酶Ⅰ（DNaseⅠ），是來(lái)源于牛胰臟的糖蛋白。它是一種需要二價(jià)陽(yáng)離子的內(nèi)切核酸酶，能從嘧啶核苷酸5'端磷酸基處隨機(jī)降解單鏈或雙鏈DNA，生成具有5'磷酸末端的寡核苷酸。當(dāng)有Mg2+存在時(shí)，能在雙鏈DNA上隨機(jī)獨(dú)立地產(chǎn)生切口；而在Mn2+存在時(shí)，則在雙鏈DNA的大致同一位置上切割，產(chǎn)生平末端DNA片段。

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脫氧核糖核酸酶Ⅰ的應(yīng)用：

在分子克隆中，DNA酶Ⅰ主要用于：與大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ聯(lián)合參與切口平移法標(biāo)記DNA分子；在Mn2+存在下，隨機(jī)裂解雙鏈DNA分子，構(gòu)建大片段插入的基因文庫(kù)；用于DNaseⅠ足跡法分析D