免疫多糖在水產(chǎn)上的應(yīng)用一、概述甲殼動(dòng)物如蝦血漿中存在免疫多糖的結(jié)合蛋白,在其血細(xì)胞膜上存在免疫多糖結(jié)合蛋白受體。進(jìn)入機(jī)體的免疫多糖與血漿中的結(jié)合蛋白結(jié)合,再與血細(xì)胞的受體結(jié)合,活化血淋巴中的吞噬細(xì)胞,提高吞噬病原的能力;刺激血淋巴液中抗菌、溶菌活力的產(chǎn)生或升高;激活酚氧化酶原系統(tǒng)產(chǎn)生識(shí)別信號(hào)及介導(dǎo)吞噬等,引發(fā)一系列的免疫反應(yīng);免疫多糖還起調(diào)理素的作用,增強(qiáng)血細(xì)胞對(duì)異物的識(shí)別能力,從而提高了其吞噬能力。促進(jìn)血細(xì)胞對(duì)真菌等較大異物的包圍殺傷能力,引起血細(xì)胞凝結(jié),有利于血細(xì)胞趨向和殺傷異物及對(duì)傷口的修復(fù)。魚(yú)類(lèi)機(jī)體內(nèi)也存在免疫多糖受體,這些受體在免疫多糖發(fā)揮免疫刺激過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。免疫多糖正是與這些受體結(jié)合后激活嗜中性粒細(xì)胞及質(zhì)細(xì)胞的吞噬作用,促進(jìn)其釋放細(xì)胞因子、白三烯等物質(zhì),并通過(guò)這些物質(zhì)來(lái)刺激其它的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生或分泌淋巴因子,以協(xié)調(diào)體液免疫和細(xì)胞免疫,刺激抗體的產(chǎn)生和補(bǔ)體的生成等,從而引起整個(gè)機(jī)體的免疫反應(yīng)。二、作用機(jī)理:國(guó)內(nèi)外大量研究已證實(shí)酵母細(xì)胞壁免疫多糖是一種功能很強(qiáng)的免疫刺激劑,其良好的免疫刺激功能主要取決于酵母多糖的初級(jí)結(jié)構(gòu)、螺旋構(gòu)象、分支情況、分子量大小和取代基團(tuán)的性質(zhì)等等(張悅等,2005)。β—葡聚糖直接激活水產(chǎn)動(dòng)物血細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的噬菌活性,甘露寡糖具有吸附水產(chǎn)動(dòng)物腸道內(nèi)有害細(xì)菌的能力,保持腸道內(nèi)的正常菌群平衡?，F(xiàn)有的研究已證實(shí)酵母細(xì)胞壁免疫多糖能有效增強(qiáng)對(duì)蝦、沼蝦、克氏原螯蝦、河蟹、鯽魚(yú)、斑點(diǎn)叉尾鮰、鰻魚(yú)、虹鱒、大西洋鮭、中華鱉、黃鱔、牙鲆、鮭魚(yú)、大黃魚(yú)、櫛孔扇貝、鮑魚(yú)等水產(chǎn)動(dòng)物機(jī)體的免疫能力,其中對(duì)提高蝦蟹非特異性免疫力的效果尤為明顯。使用效果:其在水產(chǎn)動(dòng)物中的作用主要?dú)w納起來(lái)表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:①提高水產(chǎn)動(dòng)物非特異性免疫指標(biāo)。注射或飼喂酵母細(xì)胞壁免疫多糖后,水產(chǎn)動(dòng)物血清或肝臟中的ACP、ALP、SOD、CAT、LYZ、PO酶的活性、白細(xì)胞的吞噬指數(shù)、吞噬比例均得到明顯地改善;汪小峰(2006)的研究則認(rèn)為酵母細(xì)胞壁免疫多糖能顯著提高對(duì)蝦細(xì)胞中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的數(shù)量,從而提高對(duì)蝦的PO產(chǎn)量;②促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物淋巴細(xì)胞的增殖,促進(jìn)漿細(xì)胞產(chǎn)生更多的抗體,提高水產(chǎn)動(dòng)物的特異性免疫應(yīng)答反應(yīng);③顯著提高水產(chǎn)動(dòng)物抗病能力,降低水產(chǎn)動(dòng)物攻毒后的感染率和成活率;④能有效降低肝臟損傷,顯著降低水產(chǎn)動(dòng)物血液中GPT、GOT的活性,⑤酵母細(xì)胞壁免疫多糖對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物具有一定促生長(zhǎng)的作用。三、在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)上的應(yīng)用免疫多糖在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究越來(lái)越多,水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用免疫多糖有明顯的促進(jìn)魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)和提高魚(yú)的成活率的作用。李海燕等在豐產(chǎn)鯽飼料中添加0.8%的免疫多糖,結(jié)果顯示,豐產(chǎn)鯽體長(zhǎng)、體重都有明顯提高,并且能有效地抵抗赤皮病的發(fā)生,大大提高魚(yú)的成活率。另外,利用免疫多糖來(lái)提高魚(yú)類(lèi)的非特異性免疫機(jī)能和增加其對(duì)病原菌的抵抗力,是一種極為有效的、具有廣闊發(fā)展前景的方法。在鯉魚(yú)飼料中加入免疫多糖可促使鯉魚(yú)血液NBT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增加和血清溶菌酶活力提高(P<0.05),明顯改善鯉魚(yú)的非特異性免疫功能[5]。在異育銀鯽飼料中按每千克體重添加150.0mg的免疫多糖,對(duì)受免異育銀鯽的免疫應(yīng)答具有較強(qiáng)的調(diào)節(jié)效應(yīng),能增強(qiáng)異育銀鯽非特異性免疫功能[23]。通過(guò)注射途徑使用免疫多糖能夠提高大麻哈魚(yú)和虹鱒體內(nèi)溶菌酶水平以及增強(qiáng)虹鱒外周白細(xì)胞的吞噬能力[24-26]。在赤眼鱒飼料中添加免疫多糖的研究結(jié)果也表明,添加了0.5%和0.8%YPS的飼料組能顯著提高赤眼鱒SOD活性、溶菌酶活性、補(bǔ)體C3水平、白細(xì)胞吞噬活性、紅細(xì)胞的免疫功能;而添加了0.2%的免疫多糖飼料只能顯著提高溶菌酶活性[27]。因而,在魚(yú)類(lèi)的生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用免疫多糖具有很好的飼養(yǎng)效果。在南美白對(duì)蝦飼料中按每千克體重添加100mg的免疫多糖,顯著提高供試南美白對(duì)蝦血清和肌肉中酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(ALP)和過(guò)氧化物酶(POD)的活性(t測(cè)驗(yàn),P<0.05),極顯著地提高肝胰腺中ACP、ALP和POD的活性(t測(cè)驗(yàn),P<0.01),增強(qiáng)抗哈維弧菌感染的能力[28]。在水溫為(20.0±3)℃,鹽度為(30.0±1.5)‰的條件下,采用50mg/l質(zhì)量濃度免疫多糖浸泡皺紋盤(pán)鮑,發(fā)現(xiàn)YPS能增強(qiáng)皺紋盤(pán)鮑血細(xì)胞產(chǎn)生活性氧的能力和增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用,加強(qiáng)體液免疫,提高鮑血清凝集活力,可作鮑魚(yú)的免疫增強(qiáng)劑[29]。于櫛孔扇貝體中注射免疫多糖后,均有增強(qiáng)參與免疫防御的血淋巴中酚氧化酶(PO)和髓過(guò)氧物酶(MPO)活性的作用。使其產(chǎn)生防御反應(yīng),包括提供調(diào)理素,促進(jìn)血細(xì)胞吞噬作用、包囊作用和結(jié)節(jié)形成,以及介導(dǎo)凝集和凝固、產(chǎn)生殺菌物質(zhì)等作用[30]。免疫多糖對(duì)櫛孔扇貝血淋巴中可清除自由基的抗氧化酶——超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)的活力有增強(qiáng)作用,同時(shí)能提高血清中的酶活力[31]。而SOD和CAT在貝類(lèi)免疫防御中發(fā)揮重要作用,SOD可清除體內(nèi)的O2-·和·OH,CAT可清除H2O2[32],從而保護(hù)貝類(lèi)本身免受傷害。酵母細(xì)胞壁免疫多糖與VC有明顯的協(xié)調(diào)作用,如β-(1,3)葡聚糖與VC配合,對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦生長(zhǎng)和抗病力效果很好。可以大大的促進(jìn)生長(zhǎng)、提高成活率,降低飼料系數(shù)。3.1常量添加,成本控制常量添加在飼料中的量通常應(yīng)控制在0.3%~0.5%以?xún)?nèi),如0.1%~0.2%的添加量即能產(chǎn)生顯著的效果。飼喂后基本的評(píng)價(jià)指標(biāo)為:增重率,飼料系數(shù),死亡率,相關(guān)免疫指標(biāo),攻毒感染率等。例如譚北平等(2005)在基礎(chǔ)飼料粗蛋白質(zhì)含量41%、脂肪含量7%的飼料中分別添加0.1%、0.2%和0.4%,以不添加作為對(duì)照,采用近似飽食投喂法投喂凡納對(duì)蝦60d,試驗(yàn)結(jié)果表明:添加葡聚糖組飼料系數(shù)顯著低于對(duì)照組,對(duì)蝦增重率均高于對(duì)照組的。添加酵母細(xì)胞壁免疫多糖組的血細(xì)胞總量、白細(xì)胞吞噬指數(shù)、吞噬百分比及酚氧化酶的活性均顯著高于對(duì)照組。采用白斑病毒攻毒7d后,各試驗(yàn)組對(duì)對(duì)蝦的免疫保護(hù)力均在80%以上;攻毒14d后,添加酵母細(xì)胞壁多糖組凡納濱對(duì)蝦的死亡率僅為20%、16.6%、16.6%,顯著低于對(duì)照組80%的死亡率。且在本投飼策略下,全周期(60d)養(yǎng)殖期間投喂β-葡聚糖并沒(méi)有產(chǎn)生免疫疲勞或其他副作用。因此,從提高免疫力的角度,凡納對(duì)蝦飼料中β-葡聚糖制劑的推薦添加量為0.1%;若考慮促進(jìn)生長(zhǎng),則添加量建議上升到0.2%。3.2預(yù)防治療添加,效果控制預(yù)防治療添加的主要特點(diǎn)為階段使用,但添加量較高,通常在0.5%~2%以?xún)?nèi)。使用的重點(diǎn)在于在發(fā)病季節(jié)前階段性高劑量的添加,如池塘養(yǎng)殖草魚(yú)疾病高發(fā)季節(jié)4月份和6~7月份前,提前3~4周使用。對(duì)于在此期間出現(xiàn)明顯病癥的魚(yú),可少量采用國(guó)家允許使用的藥物及時(shí)進(jìn)行潑灑或拌餌治療,這樣能有效地降低水產(chǎn)動(dòng)物在疾病高發(fā)季節(jié)的發(fā)病率和死亡率,同時(shí)可以明顯減少藥物的使用,對(duì)避免進(jìn)一步的藥害,確保水產(chǎn)品的安全和品質(zhì)極其重要。此方法的基本評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)仍然可以采用水產(chǎn)動(dòng)物的死亡率、病害感染率、增重率、飼料系數(shù)等生產(chǎn)指標(biāo),相關(guān)免疫指標(biāo)及肝臟受損程度,相關(guān)酶指標(biāo)如GOT、GPT等也可作為研究和應(yīng)用的評(píng)價(jià)指標(biāo)。此外,綜合養(yǎng)殖成本的核算也可納入評(píng)價(jià)指標(biāo)。一般添加成本應(yīng)遠(yuǎn)低于平均該地區(qū)月份水產(chǎn)動(dòng)物的死亡損失或藥物治療的添加成本。如陳昌福等(2006)在飼料中分別添加50~250mg/kg體重的酵母細(xì)胞壁免疫多糖飼喂平均體重171g的鯽魚(yú)28d,日均投喂量為魚(yú)體重的2%左右,結(jié)果表明:鯽魚(yú)血清的總蛋白含量隨著添加量的增加而顯著增加,血清凝集抗體效價(jià)、溶菌酶的活性、白細(xì)胞的吞嗜指數(shù)(PI)和吞嗜百分比(PI)均顯著高于對(duì)照組,而血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性則呈現(xiàn)出顯著下降的趨勢(shì)。養(yǎng)殖結(jié)束后采用嗜水氣單胞菌對(duì)鯽魚(yú)進(jìn)行攻毒試驗(yàn),試驗(yàn)組鯽魚(yú)的死亡率均在20%~30%,遠(yuǎn)低于對(duì)照組的86.7%的死亡率,其中添加200mg/kg體重和250mg/kg體重的試驗(yàn)組(相當(dāng)于飼料中分別添加1%和1.25%)死亡率最低,其免疫保護(hù)率分別高達(dá)76.9%和73.1%。筆者于今年8月中下旬,對(duì)武漢東西湖地區(qū)柏泉農(nóng)場(chǎng)草魚(yú)混養(yǎng)池塘進(jìn)行為期1個(gè)半月的大塘試驗(yàn),也獲得了很好的研究結(jié)果。在商品飼料中添加5g/kg酵母細(xì)胞壁免疫多糖的試驗(yàn)組,試驗(yàn)期間草魚(yú)死亡率僅為0.12%,而對(duì)照組則高達(dá)2%~3.75%。與此同時(shí),試驗(yàn)期間試驗(yàn)組所用的消毒、治療藥物的費(fèi)用僅為16.26元/畝,而對(duì)照組消毒、治療費(fèi)用平均在27元/畝以上。因?qū)φ战M魚(yú)持續(xù)死亡,消毒、殺蟲(chóng)不斷,根本無(wú)法實(shí)現(xiàn)調(diào)水,而試驗(yàn)組則在試驗(yàn)期間成功利用200億/g的枯草芽孢桿菌進(jìn)行了兩次調(diào)水,試驗(yàn)結(jié)束時(shí),試驗(yàn)組草魚(yú)生長(zhǎng)明顯優(yōu)于對(duì)照組,進(jìn)一步的解剖發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組草魚(yú)背部肌肉厚實(shí),鱗片的光澤度好。3.3具有廣譜性,水產(chǎn)養(yǎng)殖對(duì)象擴(kuò)展此使用方法的基本評(píng)價(jià)指標(biāo)同前,添加量可以采用常規(guī)添加方式,也可以采用預(yù)防添加的方式。具體采用何種方式合理,首先需要對(duì)當(dāng)?shù)氐酿B(yǎng)殖模式、養(yǎng)殖成本和疾病高發(fā)季節(jié)有所了解,同時(shí)還要視當(dāng)年養(yǎng)殖水產(chǎn)動(dòng)物的市場(chǎng)價(jià)格和飼料價(jià)格走勢(shì)而定。一般而言,水產(chǎn)品終端價(jià)格高企,利潤(rùn)空間較大時(shí),可采用預(yù)防添加的方式進(jìn)行添加。如華中農(nóng)業(yè)大學(xué)的陳昌福教授(2007)在商品鰻魚(yú)飼料中添加100、300、500mg/kg體重的酵母細(xì)胞壁免疫多糖,以不添加組作為對(duì)照,養(yǎng)殖28d后,300mg/kgB.W和500mg/kgB.W組鰻魚(yú)白細(xì)胞吞嗜指數(shù)、吞嗜百分比顯著高于對(duì)照組,血清中溶菌酶和補(bǔ)體C3、C4的活性均高于對(duì)照組。因此,在鰻魚(yú)飼料中可采用階段預(yù)防添加的模式,添加量300~500mg/kg體重為宜。酵母細(xì)胞壁免疫多糖作為免疫增強(qiáng)劑,國(guó)內(nèi)外在許多水產(chǎn)動(dòng)物上都得到了證實(shí),如對(duì)蝦、小龍蝦、羅氏沼蝦、河蟹、鯽魚(yú)、中華鱉、黃鱔、虹鱒、鰻鱺、海鱸、牙鲆、大菱鲆、叉尾鮰等。3.4結(jié)合飼料配方調(diào)整與優(yōu)化,成本效果控制此種使用方法需要了解當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖模式、基本飼料配方組成及原料成本,通過(guò)經(jīng)典的養(yǎng)殖試驗(yàn)或中試,提出養(yǎng)殖效果相當(dāng)?shù)呐浞叫薷慕ㄗh。如劉立鶴(2005)研究了不同飼料配方下β-葡聚糖和魚(yú)粉添加水平對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)、非特異性免疫力的影響及成本分析,研究表明:凡納濱對(duì)蝦飼料中10%魚(yú)粉組對(duì)蝦增重率顯著低于20%和25%組(P<0.01),而20%和25%魚(yú)粉組凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能并無(wú)顯著差異。在20%和25%魚(yú)粉添加組,添加β-葡聚糖有一定促進(jìn)對(duì)蝦的生長(zhǎng),、降低飼料系數(shù)的功效,血清、組織中非特異免疫指標(biāo)的酶活性均有一定程度的提高。因此,在養(yǎng)殖效果相當(dāng)?shù)那疤嵯?適當(dāng)降低魚(yú)粉的含量(如魚(yú)粉含量從目前配方中的25%降低至20%),添加β-葡聚糖并調(diào)整配方,即可有效地降低飼料成本。在廣東一些飼料廠家生產(chǎn)的粗蛋白質(zhì)為25%的草魚(yú)配方中,通過(guò)降低豆粕的添加量,適當(dāng)增加棉籽粕使用量,并常量添加酵母細(xì)胞壁多糖,也在確保養(yǎng)殖效果的前提下,實(shí)現(xiàn)了飼料配方成本和養(yǎng)殖病害的有效控制。3.5使用方法擴(kuò)展,擴(kuò)大外延,效果控制近些年,隨著酵母細(xì)胞壁免疫多糖應(yīng)用的推廣和普及,已不僅僅局限于作為飼料添加劑直接添加到飼料中,其使用方法得到了極大的拓展,具體體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:①作為疫苗佐劑,配合疫苗使用,采用注射或浸泡的方法可直接提高水產(chǎn)動(dòng)物的抗病和抗應(yīng)激能力。在實(shí)際的生產(chǎn)實(shí)踐中,注射效果較穩(wěn)定,但由于受到操作強(qiáng)度和難度的限制,類(lèi)似草魚(yú)四聯(lián)注射疫苗的推廣和普及率一直不高。但是針對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的親本或者比較大型的養(yǎng)殖動(dòng)物如鱘魚(yú),采用注射的方法可以取得很好的養(yǎng)殖效果。如陳昌福(2006)對(duì)克氏原螯蝦體內(nèi)注射免疫多糖24h、48h和72h后,測(cè)定其血清、肝胰腺和肌肉中的ACP、AKP等酶活性,發(fā)現(xiàn)其均高于對(duì)照組,其中肝胰腺中ACP和AKP的酶活顯著高于對(duì)照組;②作為免疫增強(qiáng)劑直接伴餌投喂,此使用主要適合一些以粉狀料為主的水產(chǎn)動(dòng)物飼料,如黃鱔飼料、鰻魚(yú)飼料、甲魚(yú)、河魨飼料等。近些年,開(kāi)發(fā)出來(lái)的花鰱粉狀飼料中直接將酵母細(xì)胞壁免疫多糖拌餌投喂,也可獲得很好的養(yǎng)殖效果;③刈草喂魚(yú)仍然是我國(guó)草魚(yú)養(yǎng)殖的一種模式,以草喂魚(yú)雖然可以節(jié)約大量的飼料成本,但也存在著飼料系數(shù)高、水質(zhì)不易控制、疾病容易暴發(fā)等缺點(diǎn)。酵母細(xì)胞壁免疫多糖具有較好的粘性,采用和水、和面等方式直接將酵母細(xì)胞壁免疫多糖噴涂或涂布于草上飼喂草魚(yú),可有效降低養(yǎng)殖期間草魚(yú)發(fā)病率和死亡率;④將酵母細(xì)胞壁免疫多糖(可與基礎(chǔ)配方按比例)制成小顆粒藥劑,在魚(yú)病發(fā)生前期或初期,按照添加量折算后,按一定比例直接加入飼料中投喂。此法適合以顆粒料飼養(yǎng)的網(wǎng)箱養(yǎng)殖,也適合普通池塘養(yǎng)殖;⑤可在水產(chǎn)動(dòng)物育苗階段使用,如王新霞(2004)的研究表明在中國(guó)對(duì)蝦育苗中使用0.3~0.5mg/ml的β-葡聚糖浸浴,可顯著提高蚤狀幼體的變態(tài)率和生長(zhǎng),可顯著提高副溶血弧菌攻毒后的成活率。3.6擴(kuò)展應(yīng)用范圍,充實(shí)和認(rèn)識(shí)飼料功效隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖和飼料配方技術(shù)的不斷提高,人們對(duì)飼料的功效不斷地得到充實(shí)和提升。針對(duì)不同階段飼料的功效,酵母壁細(xì)胞免疫多糖在魚(yú)類(lèi)的越冬、抗凍、耐運(yùn)輸和抗輻射等方面發(fā)揮重要作用。筆者(2008)在國(guó)產(chǎn)魚(yú)粉3%、豆粕13%、菜籽粕28%、棉籽粕10%、DDGS4%、油糠10%、玉米蛋白粉5%、次粉20.70%、磷脂粉1%、沸石粉1%、膨潤(rùn)土1%、磷酸二氫鈣、食鹽0.3%,外加1%預(yù)混料的基礎(chǔ)飼料配方中分別添加0.1%、0.2%、0.4%的酵母細(xì)胞壁免疫多糖,以基礎(chǔ)配方作為對(duì)照。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)為300L的玻璃缸中放置均重55g健康的草魚(yú)15尾,喂養(yǎng)56d,全程控溫22℃。試驗(yàn)期間除每7d消毒一次水體外,對(duì)部分發(fā)病的草魚(yú)也不使用任何其他藥物。試驗(yàn)結(jié)束后對(duì)照組草魚(yú)成活率僅為26.7%,而添加0.1%、0.2%、0.4%的酵母細(xì)胞壁免疫多糖試驗(yàn)組草魚(yú)的成活率分別為46.7%、55.6%和53