葉綠素的提取和分別一、試驗過程1、提取綠色葉片中的色素將除去葉柄和粗葉脈的5g左右新奇綠色葉片（菠菜葉或白菜葉、女貞葉），剪碎，放在研缽中，加入少許二氧化硅和碳酸鈣，進行充分的研磨，當研磨成糊狀時，再加入5-6ml丙酮，用杵棒快速攪動后，靜止3-5min,就可看到丙酮提取液為深綠色，再將澄清的提取液直接收集到有色的小廣口瓶中（不經過濾X丙酮具有肯定的毒性并且很簡單揮發(fā)。在進行試驗操作時盡量少吸入丙酮，攪動后靜止時，用紙或塑料薄膜蓋在研缽上。由于葉綠體中的各種色素都是脂類化合物，不溶于水，只溶于酒精、乙烷、丙酮、石油醛等有機溶劑中，且用丙酮的效果較好，加入丙酮就是為了快速提取色素。又因丙酮的化學性質不穩(wěn)定,極易揮發(fā)，所以必需在充分的研磨后加入，而不在研磨前或研磨中加入。在試驗過程中，發(fā)覺在研缽中加入2ml丙酮，數(shù)量不足，色素提取液量不多，假如再經脫脂棉過濾，濾液幾乎全被吸走，提取色素困難，所以改成加入丙酮5-6ml。將色素收集到有色的小廣口瓶中，目的是避開葉綠體中的色素，在接觸空氣或光照下遭到破壞。2、制備濾紙條取一張預先干燥處理過的定性濾紙,將濾紙剪成8-9cm長，1cm寬的濾紙條，再將濾紙條的一端對折剪去兩角。3、畫濾液細線用牙簽（或用鋼筆尖、六號注射針頭等）代替毛細吸管，蘸取有色小廣口瓶中濾液，沿鉛筆線處當心勻稱地劃出一條濾液細線，劃的線條越細越齊（直），而且待濾液干燥后，連續(xù)重復畫4~5遍，試驗效果越好。4、葉綠體中的色素分別將4ml層析液倒入100ml燒杯中，再將濾紙條（有濾液細線的一端朝下）略微傾斜靠著燒杯的內壁，輕輕地插入到層析液中，隨后用培育皿蓋蓋上燒杯，濾紙上的濾液細線要與層析液離開肯定的距離，即層析液不能沒及濾紙條上的濾液細線。5、試驗結果的觀看層析幾分鐘以后（約4~5min）,濾紙條上便清晰地呈現(xiàn)出四條色素帶，從上而下依次是胡蘿卜素（橙黃色），葉黃素（黃色），葉綠素a（藍綠色），葉綠素b（黃綠色X取出濾紙條，待濾紙條稍干燥后，隨堂觀看試驗結果，或待濾紙條完全干燥后，粘貼在試驗冊的報告欄上，避光保存。（注：為了加速干燥，可以用嘴對著濾紙條輕輕地吹，但不能放在陽光下曬。）三、試驗失誤的常見緣由及對策1、濾液過?。禾崛∩匾翰僮鲿r，方法欠妥，濾液黃綠色，濃度稀，試驗效果欠佳,只有深綠透亮的濾液，才能達到好的分別效果。（1）材料選用不當，有的綠葉材料，不都是效果最優(yōu)的，不能盲從。宜選老嫩適中且濃綠的葉，如：菠菜、青菜、天竺葵、馬鈴薯、甘薯的葉。(2)所選葉片剪得不碎，加之研磨不充分。試驗操作時，盡可能剪碎葉片，可把幾張葉片疊放一起，先剪成絲，再一起橫著剪碎，這樣省時省力。加入少許SiO2,CaC03且快速充分研磨，研120轉左右，使研磨液呈勻漿狀為好，這樣各種色素才能充分溶解在提取液里(丙酮或無水乙醇)。(3)過濾時，漏斗基部的脫脂棉太多(或"尼龍布"不是單層)。過濾時，使用脫脂棉盡可能少，便于得到深綠色的透亮濾液，能阻攔住葉渣即可。切忌用過濾紙過濾，否則色素被汲取，降低濾液中色素的濃度。(4)加入提取液過多，導致濾液中色素含量低。對策是將稀提取液和新添碎葉放入研缽再研。此法也是上述的補救措施。2、濾液不純：提取液含有過多的雜質或變質，會嚴峻影響試驗結果。(1)葉片表面含有水珠或葉片內含水量過高，降低提取液對色素的抽提效率，且影響層析。對策是用吸水紙或脫脂棉擦去葉片表面水珠，不用過嫩的葉，必要時加少許脫水劑硫酸鈉。(2)加入過多的二氧化硅和碳酸鈣，這樣既影響過濾，又使濾液中有顆粒物，降低濾液濃度。對策是掌握用量，一般各加0.lg。(SiO2起研磨粉作用，破壞細胞結構。CaCO3與有機酸反應，是葉綠素的愛護劑)。(3)濾液存放時間過長，光線和空氣的作用，緩慢的有機反應，將溶解的色素破壞,溶液變?yōu)楹稚?，即葉綠素嚇琳環(huán)中的鎂可被H+或Cu2+所取代。液泡膜裂開流出的鞅酸、草酸等有機酸產生的H+置換了葉綠素中的鎂后，可以形成褐色的去鎂葉綠素。3.濾液線畫得過細：畫好濾液線是試驗的難點和關鍵，否則現(xiàn)象不明顯。(1)濾液線畫得不勻實。原人教版教材上講越細越齊效果越好，新老教材上都講畫濾液細線，極易產生誤導。導致同學畫的濾液線過淺，線上色素量太少，其實最關鍵的是畫線后綠色較深。實際操作中，每畫一次、用電吹風吹干，可重復幾次，便于積累色素成分,力求深、齊、勻，線粗1~2mm,可用醫(yī)院驗血時用來吸血的毛細吸管畫。(2)濾液線畫得距濾紙剪角端太近，易使色素溶解于層析液中，不能在濾紙條上向上集中，距剪角端l.5cm處畫線,層析速度適中，效果最佳。四.同學通過親試驗主動地發(fā)覺的問題是：四.同學通過親試驗主動地發(fā)覺的問題是：1)蔥和紅薯葉很難或不能提取到色素，為什么？2)為何有些蔬菜葉片，如生菜和芹菜葉片，明明是綠色的，經研磨后變成了黑色或褐色？3)為什么紅扶桑葉片是褐紅色的，濾液也是褐紅色，但仍能分別出橙黃色、黃色、藍綠色和黃綠色4條色素帶？而淡黃色的大白菜不能？4)為什么有些試驗結果的第2條色素帶清晰，有些不太清晰？同一株植物上不同部位的葉片做出來的試驗結果也不一模一樣，為什么？老師引導同學通過查閱資料集體爭論，對上述問題得出的答案如下:1）紅薯葉片和蔥葉片由于含有粘液質，色素被粘液質粘聚在一起，因此，提取色素時,色素不被溶解或很難溶解到丙酮中，提取不到色素，所以做不了試驗。2）生菜（黃苣）和芹菜一樣，在進行色素提取時，都會發(fā)生褐變，緣由是這些蔬菜中含有還原糖、氨基酸和蛋白質等成分。還原糖與氨基酸或蛋白質起反應，生成黑蛋白，發(fā)生了褐變。所以收集到的濾液，顏色是淺黑色或褐色的。但這些褐變的濾液并不影響葉綠體中的4種色素的提取和分別，仍能形成色素帶。黑蛋白在濾液細線四周，不隨著層析液在濾紙上集中。3）紅扶桑葉片的細胞液中含有較多的花青素，呈褐紅色，所以提取色素時，濾液的顏色是褐紅色的，但這些濾液中除含有花青素外，還含有葉綠素a、葉綠素b、葉黃素和胡蘿卜素。所以，在色素分別時，葉綠體中的4種色素仍能分別出來，形成正常的色素帶，而紅色的花育素在濾液細線四周，不隨著層析液在濾紙上集中，因此濾液細線四周是紅色的。4）淡黃色