綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)-化學(xué)生物學(xué)專題實(shí)驗(yàn)

指導(dǎo)教師：馬林，蔡小玲

抗菌藥物篩選的實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)一個(gè)新的化合物或分離提取有效成分是否有抗菌作用，需要藥理實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)，首先采用體外實(shí)驗(yàn)方法，觀察試驗(yàn)物對(duì)細(xì)菌有無(wú)殺滅作用或抑制作用，體外實(shí)驗(yàn)的重要性在于方法簡(jiǎn)便，用藥量少，短時(shí)間內(nèi)能判斷藥物抗菌的廣度和強(qiáng)度，為深入體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)藥效研究提供數(shù)據(jù)。體外實(shí)驗(yàn)是篩選抗菌藥物或測(cè)試新藥抗菌性能的重要環(huán)節(jié)。藥物對(duì)細(xì)菌代謝的影響、可以使細(xì)胞呼吸量減低，或酶系統(tǒng)受到抑制等，因而出現(xiàn)細(xì)菌不生長(zhǎng)或部分抑制，可借以判斷藥物對(duì)細(xì)菌有無(wú)抗菌作用，或抗菌范圍。體外實(shí)驗(yàn)是細(xì)菌與藥物直接接觸，沒有機(jī)體諸因素參與，故體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果不一定完全一致，需兩方面綜合分析進(jìn)行評(píng)價(jià)。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，掌握培養(yǎng)基的制備、高壓蒸氣滅菌、菌種培養(yǎng)、接種等微生物培養(yǎng)技術(shù)；2，掌握化合物抗菌、抑菌活性篩選技術(shù)；3，掌握微孔板法、抑菌圈法抗菌最小濃度測(cè)試等基本操作技術(shù)。4，學(xué)會(huì)使用各種儀器設(shè)備。實(shí)驗(yàn)中使用的儀器設(shè)備：1，手提式高壓蒸汽滅菌鍋；2，超凈工作臺(tái)；3，各種移液器；4，細(xì)菌恒溫培養(yǎng)箱；5，微生物培養(yǎng)搖床；6，酶標(biāo)儀；（一）基本原理正確掌握培養(yǎng)基的配制方法是從事微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)工作的重要基礎(chǔ)。由于微生物種類及代謝類型的多樣性，因而用于培養(yǎng)微生物培養(yǎng)基的種類也很多，它們的配方及配制方法雖各有差異。但一般培養(yǎng)基的配制程序卻大致相同，例如器皿的準(zhǔn)備，培養(yǎng)基的配制與分裝，棉塞的制作，培養(yǎng)基的滅菌，斜面與平板的制作以及接菌等基本環(huán)節(jié)大致相同。

（二）實(shí)驗(yàn)過(guò)程1，液體及固體培養(yǎng)基的配制過(guò)程一般培養(yǎng)基的組成牛肉膏0.5g蛋白胨1gNaCl0.5g

瓊脂1.5-2g水100mlpH7.2液體培養(yǎng)基不加瓊脂即可。(1)稱量及溶化分別稱取蛋白胨、NaCl、牛肉膏置于另一小燒杯中，進(jìn)行稱量。然后加入少量蒸餾水于小燒杯中，加熱融化。(2)調(diào)pH待溶液冷至室溫時(shí)，用0.1mol/LNaOH溶液調(diào)pH至7.2。(3)定容將溶液倒入量筒中，補(bǔ)充水量至所需體積。(4)固體培養(yǎng)基加入所需量的瓊脂，加熱融化，補(bǔ)充失水。(5)分裝、加塞、包扎。(6)高壓蒸汽滅菌100Pa滅菌20min2，培養(yǎng)基的分裝液體培養(yǎng)基裝入試管培養(yǎng)基的量視試管大小及需要而定，若所用試管大小為15×150mm時(shí)，液體培養(yǎng)基可分裝至試管高度1/4左右為宜（約5ml）；分裝團(tuán)體培養(yǎng)基時(shí)，在瓊脂完全融化后，應(yīng)趁熱分裝于試管中分裝量為管高1/5(約4-5ml)。4，培養(yǎng)基的滅菌高壓蒸汽滅菌是微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)、發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)、以及外科手術(shù)器械等方面最常用的一種滅菌方法。（1）打開滅菌鍋蓋，加適量水；（2）將待滅菌物品放入滅菌桶內(nèi)。（3）將蓋上的軟管插入滅菌桶的槽內(nèi)，加蓋，上下螺栓口對(duì)齊，均勻旋緊螺栓，使鍋密閉。（4）打開放汽閥，加熱，自鍋內(nèi)開始產(chǎn)生蒸汽后再關(guān)緊放汽閥，待壓力逐漸上升至所需溫度時(shí)，控制熱源，維持所需壓力和溫度，并開始計(jì)時(shí)20min后停止加熱。（5）待壓力降至接近0時(shí)，慢慢打開放汽閥(排汽口)，開蓋，立即取出滅菌物品。5，斜面和平板的制作將巳滅菌裝有瓊脂培養(yǎng)基的試管，趁熱置于木棒上，使成適當(dāng)斜度，凝固后即成斜面(圖1-3)斜面長(zhǎng)度不超過(guò)試管長(zhǎng)度1/2為宜。平板的制作7，液體培養(yǎng)基接種法三、微量稀釋法體外抗菌實(shí)驗(yàn)連續(xù)稀釋法（試管稀釋法）通常用于測(cè)定微生物的最小抑菌濃度（MIC），即將微生物的濃度按幾何級(jí)數(shù)或數(shù)學(xué)級(jí)數(shù)進(jìn)行遞減稀釋，然后將不同濃度的微生物混入含試驗(yàn)菌的液體培養(yǎng)基或固體培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)后，能抑制試驗(yàn)菌生長(zhǎng)的最低濃度，即為該微生物的最小抑菌濃度。微量稀釋法此種方法常用于測(cè)定細(xì)菌對(duì)藥物敏感性或新藥對(duì)細(xì)菌的抗菌活性試驗(yàn)。一般應(yīng)用96孔微量稀釋板，孔底呈U型，每孔容量為0.20-0.30ml。本法操作較便，用培養(yǎng)基量少，可作大批量藥敏試驗(yàn)。(一）實(shí)驗(yàn)過(guò)程（1）實(shí)驗(yàn)菌的準(zhǔn)備。選取大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylicoccusaureus)、白色葡萄球菌(Staphylococcusalbus)、蠟狀芽孢桿菌菌種在營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)一次后，再將其接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)6-12h，冰箱備用。（2）抗菌化合物的初步篩選，按下表取96孔培養(yǎng)板一塊，進(jìn)行編號(hào)，將44種化合物（由有機(jī)化學(xué)研究所其他教師和研究生提供）用DMSO或蒸餾水配制成50mol/ml，（也可用無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾后）放置在滅菌的小離心管中。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板加樣安排123456789101112A培養(yǎng)液200l樣品1234567891011B培養(yǎng)液200l樣品1234567891011C培養(yǎng)液200l樣品1213141516171819202122D培養(yǎng)液200l樣品1213141516171819202122E菌對(duì)照(2lDMSO)樣品2324252627282930313233F菌對(duì)照(2lDMSO)樣品2324252627282930313233G菌對(duì)照(2lDMSO)樣品3435363738394041424344H菌對(duì)照(2lDMSO)樣品3435363738394041424344樣品濃度0.02mmol/ml樣品分子量/100.mg用DMSO配成0.5ml即可，每次實(shí)驗(yàn)用2l，96孔板的孔體積200l，樣品的最終濃度為200mol/L，大于該濃度則無(wú)價(jià)值。試驗(yàn)用樣品環(huán)丙沙星2,4,3-三羥基二苯甲酮2,4,4-三羥基二苯甲酮2,4,2-三羥基二苯甲酮2,3,4,2-四羥基二苯甲酮2,3,4,3-四羥基二苯甲酮2,3,4,4-四羥基二苯甲酮2,4,2,4-四羥基二苯甲酮2,3,4,2,4-五羥基二苯甲酮丹皮酚丹皮酚-鎳（II）配合物丹皮酚-氧釩（V）配合物丹皮酚-銅（II）配合物丹皮酚-鈷（II）配合物丹皮酚-錳（II）配合物丹皮酚-鋅（II）配合物苯甲基-N-苯基亞胺3-羥基苯甲基-N-苯基亞胺4-羥基苯甲基-N-2,4-二甲氧基苯基亞胺2-羥基苯甲基-N-3,5-二苯基亞胺3,4-二羥基苯甲基-N-苯基亞胺4-羥基苯甲基-N-3,4-二甲氧基苯基亞胺

23.4-羥基-3-甲氧基-N-2,4-二甲氧基苯基亞胺24.苯甲基-N-4-羥基苯基亞胺3,4-二羥基苯甲基-N-2,4-二甲氧基苯基亞胺4-羥基苯甲基-N-4-羥基苯基亞胺3,5-二羥基苯甲基-N-3,4-二甲氧基苯基亞胺2,5-二羥基苯甲基-N-4-羥基苯基亞胺2,4-二羥基苯甲基-N-4-羥基苯基亞胺2,4-二羥基苯甲基-N-2,4-二甲氧基苯基亞胺4-羥基苯甲基-N-3-羥基苯基亞胺3,5-二羥基苯甲基-N-2,4-二甲氧基苯基亞胺4-羥基-3-甲氧基-N-3,4-二甲氧基苯基亞胺4-羥基苯甲基-N-4-甲基苯基亞胺4-羥基-3-甲氧基苯甲基-N-4-甲基苯基亞胺3,5-二羥基苯甲基-N-4-甲基苯基亞胺2,4-二羥基苯甲基-N-4-甲基苯基亞胺4-磺酸基-3,4-二羥基偶氮苯4-磺酸基-2,4-二羥基偶氮苯4-硝基-3,4-二羥基偶氮苯4-硝基-2,4-二羥基偶氮苯4-硝基-2,5-二羥基偶氮苯4-溴-3,4-二羥基偶氮苯對(duì)羥基苯甲酸甲酯篩選數(shù)據(jù)分析測(cè)試的樣品中，1號(hào)樣為市場(chǎng)上臨床使用的環(huán)丙沙星，濃度為0.005mmol/L。其他樣品濃度為0.02mmol/L。實(shí)驗(yàn)中，以培養(yǎng)基為空白0%，以帶菌培養(yǎng)液為對(duì)照100%。如果酶標(biāo)儀630nm測(cè)試的結(jié)果中，空白為-0.2，空內(nèi)液體呈透明清澈，對(duì)照孔的值為+0.1-0.2。如果測(cè)試樣品的值也同樣達(dá)到-0.2，表明樣品在200mol/L具有較好的抗菌活性。如果測(cè)試樣品的值在對(duì)照孔和空白之間，表明樣品在高濃度有抗菌作用，請(qǐng)選取11個(gè)抗菌效果較好的樣品做下面的最小抑菌濃度實(shí)驗(yàn)。（4）最小抑菌濃度或EC50的測(cè)試

操作步驟與試管稀釋法相似，一般常用MH培養(yǎng)基，根據(jù)上面篩選試驗(yàn)選取出來(lái)的樣品，在微孔板孔內(nèi)用微量移液器直接在微孔板孔內(nèi)作二倍稀釋，然后接種稀釋菌液，其中留一列孔作為藥液對(duì)照，另一孔僅加培養(yǎng)基和菌液作為菌對(duì)照，試驗(yàn)完畢后，用微量攪拌器震蕩混勻后，置37℃溫孵12-18h，用酶標(biāo)儀630nm側(cè)吸光度。樣品稀釋后的濃度表A培養(yǎng)液200l樣品1，200M234567891011B培養(yǎng)液200l樣品1，100MC培養(yǎng)液200l樣品1，50MD培養(yǎng)液200l樣品1，25ME菌對(duì)照(2lDMSO)樣品1，12.5MF菌對(duì)照(2lDMSO)樣品1，6.25MG菌對(duì)照(2lDMSO)樣品1，3.13MH菌對(duì)照(2lDMSO)樣品1，1.56M（二）數(shù)據(jù)處理與分析抗菌藥物的最小抗菌濃度測(cè)試結(jié)果可能出現(xiàn)兩種形式：1，在某一個(gè)稀釋的樣品濃度，結(jié)果表現(xiàn)出細(xì)菌沒有生長(zhǎng)，菌液較清（可與空白培養(yǎng)基比），而下一個(gè)稀釋的樣品濃度，菌液中細(xì)菌生長(zhǎng)比較旺盛（可與含菌對(duì)照比），那么，這個(gè)稀釋的樣品濃度就為該樣品抗菌的最小濃度。這種化合物的抗菌作用可以稱為殺菌作用。如右表中紅色值中的樣品濃度就是最小抗菌濃度。培養(yǎng)液值-0.2013樣品1值-0.2094樣品2值-0.2066培養(yǎng)液值-0.2027樣品1值-0.2102樣品2值-0.2103培養(yǎng)液值-0.2005樣品1值-0.2068樣品2值-0.2112培養(yǎng)液值-0.2106樣品1值-0.2054樣品2值-0.2022菌對(duì)照值0.2182樣品1值-0.2028樣品2值0.2087菌對(duì)照值0.2068樣品1值-0.2008樣品2值0.2112菌對(duì)照值0.2146樣品1值0.2023樣品2值0.2088菌對(duì)照值0.2033樣品1值0.2036樣品2值0.2033四、瓊脂擴(kuò)散法此種方法包括紙片法，杯碟法．挖洞法等，它們的共同點(diǎn)均在平皿瓊脂內(nèi)加入適量測(cè)試細(xì)菌，按上述方法放置適量藥液在菌層上，藥物在瓊脂四周擴(kuò)散，經(jīng)孵育后，細(xì)菌生長(zhǎng)受抑制，出現(xiàn)抑菌圈，測(cè)定抑菌圈直徑，能了解細(xì)菌對(duì)藥物的敏感程度。瓊脂擴(kuò)散法可定性或初步判斷該化合物的抗菌能力，一般是將化合物稀釋后，加如含試驗(yàn)菌的混菌平板中，由于化合物在瓊脂培養(yǎng)基中的擴(kuò)散作用，使化合物周圍的試驗(yàn)菌不能生長(zhǎng)，從而產(chǎn)生抑菌圈或抑菌帶。根據(jù)抑菌圈或抑菌帶的大小來(lái)評(píng)價(jià)化合物抗菌作用的強(qiáng)弱。圖:標(biāo)準(zhǔn)曲線法圖

：鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線

雙碟、鋼管與抑菌圈位置圖S：標(biāo)準(zhǔn)品T：供試品抑菌圈直徑(mm)效果評(píng)價(jià)抑菌圈直徑≥15mm高度敏感抑菌圈直徑10-15mm中