項(xiàng)目八食品中微生物的快速檢測(cè)第一頁(yè)，共41頁(yè)。第二頁(yè)，共41頁(yè)。概述常見(jiàn)的食源性病原體:沙門菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、肉毒梭菌、大腸埃希菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌(魏氏梭菌)、豬囊尾蚴、旋毛蟲、黃曲霉等。常用微生物快速檢測(cè)方法有即用型紙片法、生物化學(xué)技術(shù)、選擇鑒定用培養(yǎng)基法、分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)、ATP生物熒光技術(shù)、LAMP法、免疫分析檢測(cè)技術(shù)、細(xì)菌直接計(jì)數(shù)法、噬菌體鑒定技術(shù)、全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)等。第三頁(yè)，共41頁(yè)?？焖贆z測(cè)——菌落總數(shù)

一次性菌落總數(shù)測(cè)試片第四頁(yè)，共41頁(yè)。第五頁(yè)，共41頁(yè)。第六頁(yè)，共41頁(yè)。第七頁(yè)，共41頁(yè)。我國(guó)細(xì)菌性食物中毒中，70%～80%是由沙門菌引起的。在食品生產(chǎn)、加工、儲(chǔ)存、運(yùn)輸、銷售等各個(gè)環(huán)節(jié)中都有污染微生物的可能。一旦污染，微生物將大量繁殖而引起食品腐敗變質(zhì)，或?qū)е率吃葱愿腥竞褪澄镏卸?。第八?yè)，共41頁(yè)。食品中病原菌的快速檢測(cè)面臨的主要問(wèn)題(1)分離、富集待測(cè)病原菌；(2)提高檢測(cè)的速度和準(zhǔn)確性，同時(shí)檢測(cè)多目標(biāo)微生物。

第九頁(yè)，共41頁(yè)。食品微生物快速檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)(1)繪制各種菌落圖譜，開(kāi)發(fā)在線檢測(cè)軟件，提高檢測(cè)效率(2)定量測(cè)定微生物細(xì)胞特征和性能，(3)克服分子生物學(xué)方法的缺點(diǎn)，簡(jiǎn)化檢測(cè)程序，使食源性病毒的檢測(cè)方法向自動(dòng)化、快速化、靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好以及簡(jiǎn)易易行(4)試驗(yàn)條件標(biāo)準(zhǔn)化及檢測(cè)的高精度和高靈敏度發(fā)展。第十頁(yè)，共41頁(yè)。微生物學(xué)概念菌落：是指細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖而形成的能被肉眼識(shí)別的生長(zhǎng)物，它是由數(shù)以萬(wàn)計(jì)相同的微生物集合而成。當(dāng)樣品被稀釋到一定程度，與培養(yǎng)基混合，在一定培養(yǎng)條件下，每個(gè)能夠生長(zhǎng)繁殖的細(xì)菌細(xì)胞都可以在平板上形成一個(gè)可見(jiàn)的菌落。菌落形成單位叫做CFU（Colony-FormingUnits）：是形成菌落的菌落個(gè)數(shù)，不等于細(xì)菌個(gè)數(shù)。兩相同細(xì)菌靠得很近或貼在一起，那么經(jīng)過(guò)培養(yǎng)這兩個(gè)細(xì)菌將會(huì)形成一個(gè)菌落，此時(shí)就是2個(gè)細(xì)菌，1CFU。菌落總數(shù)往往采用的是平板計(jì)數(shù)法，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后我們數(shù)出平板上所生長(zhǎng)出的菌落個(gè)數(shù)，從而計(jì)算出每毫升或每克待檢樣品中可以培養(yǎng)出多少個(gè)菌落，于是以CFU/ml或CFU/g報(bào)告之。第十一頁(yè)，共41頁(yè)。菌落總數(shù)：是指在一定條件下（如需氧情況、營(yíng)養(yǎng)條件、pH、培養(yǎng)溫度和時(shí)間等），每克（每毫升）檢樣所生長(zhǎng)出來(lái)菌落的總數(shù)。微生物學(xué)概念——用來(lái)判定食品被細(xì)菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量，反映食品在生產(chǎn)過(guò)程中是否符合衛(wèi)生要求，以便對(duì)被檢樣品做出適當(dāng)?shù)男l(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)。菌落總數(shù)的多少在一定程度上標(biāo)志著食品衛(wèi)生質(zhì)量的優(yōu)劣。食品菌落總數(shù)嚴(yán)重超標(biāo)，會(huì)破壞食品的營(yíng)養(yǎng)成分，加速食品腐敗變質(zhì)，使食品失去食用價(jià)值。消費(fèi)者食用微生物超標(biāo)嚴(yán)重的食品，容易患痢疾等腸道疾病，可能引起嘔吐、腹瀉等癥狀，危害人體健康安全。第十二頁(yè)，共41頁(yè)。食品中菌落總數(shù)——紙片法細(xì)菌在測(cè)試片上生長(zhǎng)后會(huì)顯示紅色斑點(diǎn)，選擇菌落數(shù)適中（30～300個(gè)）的測(cè)試片進(jìn)行計(jì)數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)后即為每毫升（或每克）樣品中所含的細(xì)菌菌落總數(shù)。第十三頁(yè)，共41頁(yè)。第十四頁(yè)，共41頁(yè)。第十五頁(yè)，共41頁(yè)。案例夏令時(shí)節(jié)是各類冷飲產(chǎn)品的銷售旺季，某市消保委近期對(duì)該市流通領(lǐng)域的冰淇淋進(jìn)行了比較試驗(yàn)。檢測(cè)顯示，22件樣品中，有10件不符合標(biāo)準(zhǔn)。其中，冰雪皇后(DQ)、酷圣石、多樂(lè)星等多個(gè)知名品牌因大腸菌群超標(biāo)等原因上了“黑榜”。據(jù)專家分析，大腸菌群超標(biāo)的主要原因是二次污染。如加工器具沒(méi)有定期清洗消毒，操作人員在上完衛(wèi)生間后洗手不徹底，個(gè)人衛(wèi)生狀況未達(dá)標(biāo)，直接影響最終產(chǎn)品的衛(wèi)生狀況。第十六頁(yè)，共41頁(yè)。檢測(cè)意義概念：大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸或醛，并產(chǎn)生β-半乳糖苷酶需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。來(lái)源：該菌主要來(lái)源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)食品的衛(wèi)生質(zhì)量，推斷食品中有否污染腸道致病菌的可能。意義：大腸菌群存在于食品中，表明未作有效的消毒處理、加工后保存條件不良或消毒后又受到污染?？焖贆z驗(yàn)這些細(xì)菌，有助于食品的衛(wèi)生管理，維護(hù)消費(fèi)者的食用安全。第十七頁(yè)，共41頁(yè)。步驟第十八頁(yè)，共41頁(yè)。第十九頁(yè)，共41頁(yè)。第二十頁(yè)，共41頁(yè)。第二十一頁(yè)，共41頁(yè)。大腸菌群測(cè)試——紙片法將乳糖、顯色劑和選擇性培養(yǎng)基加載在紙片上，經(jīng)培養(yǎng)后能夠在紙片上生長(zhǎng)并發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸的即為大腸菌群陽(yáng)性，記錄每個(gè)稀釋度大腸菌群陽(yáng)性紙片數(shù)，根據(jù)大腸菌群MPN表查出相應(yīng)的大腸菌群數(shù)。若紙片變黃或在黃色背景上呈現(xiàn)紅色斑點(diǎn)為大腸菌群陽(yáng)性紙片。紙片保持紫蘭色不變或在紫蘭色背景上呈現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，但周圍沒(méi)有黃色均為大腸菌群陰性紙片。加水的紙片第二十二頁(yè)，共41頁(yè)。大腸桿菌大腸桿菌革蘭氏染色電子顯微鏡下的出血性大腸桿菌第二十三頁(yè)，共41頁(yè)。細(xì)菌第二十四頁(yè)，共41頁(yè)。大腸菌群檢測(cè)試劑盒圖1加樣后排氣泡圖2大腸菌群陽(yáng)性（左）大腸菌群陰性（右）圖3大腸菌群試管陽(yáng)性（左）大腸菌群試劑盒陽(yáng)性（右）方法原理：與國(guó)標(biāo)法相同。事先將濃縮乳糖膽鹽培養(yǎng)基、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液、GN增菌液、7.5%氯化鈉培養(yǎng)基、包被在試劑盒中，隨時(shí)取用觀察結(jié)果：樣液變?yōu)辄S色為產(chǎn)酸、集氣窗中有氣泡為產(chǎn)氣，既產(chǎn)酸產(chǎn)氣的樣品為陽(yáng)性結(jié)果，見(jiàn)圖2、圖3。根據(jù)試劑盒的陽(yáng)性管數(shù)，參照國(guó)標(biāo)GB/T4789.3-2003的方法查MPN檢索表報(bào)告結(jié)果。第二十五頁(yè)，共41頁(yè)。操作步驟1.樣品處理：按《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)。2.加樣：將試劑盒放在臺(tái)面上，打開(kāi)盒蓋，用無(wú)菌吸管吸取3個(gè)1：10稀釋液10mL分別加入試劑盒3個(gè)大發(fā)酵培養(yǎng)基孔內(nèi)，用無(wú)菌吸管吸取3個(gè)1mL分別加入試劑盒3小發(fā)酵培養(yǎng)基孔內(nèi)。另用無(wú)菌吸管取1：10稀釋后的樣品1mL注入到9mL滅菌生理鹽水中（1：100）取此管3個(gè)1mL稀釋液加入到試劑盒另3個(gè)小發(fā)酵培養(yǎng)基孔內(nèi)。另用無(wú)菌吸管吸取稀釋后的樣品3個(gè)4mL分別加入致病菌增菌管（孔）（A、B、C）孔內(nèi)。3.排氣泡:加樣后集氣窗內(nèi)如有氣泡存在，可將試劑盒以30～45度角傾斜，（圖1）必要時(shí)可輕輕用力在桌面敲擊數(shù)下即可排出集氣窗內(nèi)氣泡。4.培養(yǎng)：將加樣后的試劑盒置36℃±1℃溫箱中，培養(yǎng)18～24h。第二十六頁(yè)，共41頁(yè)。樣品處理第二十七頁(yè)，共41頁(yè)。注意事項(xiàng)1加入樣品后不需搖勻，平拿平放。2加樣時(shí)可用一次性無(wú)菌塑料吸管，將樣品稀釋液加至試劑盒所標(biāo)刻度處。3在培養(yǎng)箱中取試劑盒時(shí)應(yīng)平托出來(lái)，不要傾斜以免由于試劑盒的傾斜將陽(yáng)性管集氣窗中的氣泡排出而影響結(jié)果。4試劑盒為一次性無(wú)菌用品，供一次性使用。第二十八頁(yè)，共41頁(yè)。

實(shí)驗(yàn)四食品中菌落總數(shù)測(cè)試本章學(xué)習(xí)要求了解食品安全微生物指標(biāo)掌握食品中菌落總數(shù)測(cè)試的快速檢測(cè)技術(shù)第二十九頁(yè)，共41頁(yè)。菌落總數(shù)測(cè)試片測(cè)試片檢測(cè)方法有操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)周期短等優(yōu)點(diǎn)，它一旦投入使用，將大大縮短檢測(cè)周期，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作并取得較大的經(jīng)濟(jì)收益，目前已被國(guó)內(nèi)很多食品工廠所認(rèn)可并使用。位列美國(guó)前100強(qiáng)的80多家食品廠，都在使用3MPetrifilm?測(cè)試片來(lái)進(jìn)行微生物的檢測(cè)第三十頁(yè)，共41頁(yè)。原理測(cè)試片是美國(guó)3M公司發(fā)明的一種進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)的干膜，采用可再生的水合物材質(zhì)，由上下兩層薄膜組成。上層聚丙烯薄膜含有粘合劑、指示劑及冷水可溶性凝膠；下層聚乙烯薄膜含有細(xì)菌生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。細(xì)菌在測(cè)試片上生長(zhǎng)時(shí)，細(xì)胞代謝產(chǎn)物與上層的指示劑TTC發(fā)生氧化還原反應(yīng)，將指示劑還原成紅色非溶解性產(chǎn)物三苯甲，從而使細(xì)菌著色。故測(cè)試片上紅色菌落判斷為菌落總數(shù)。具體方法詳見(jiàn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T1897-2007食品中菌落總數(shù)的測(cè)定Petrifilm?測(cè)試片法。第三十一頁(yè)，共41頁(yè)。測(cè)試片法適合于各類食品及食品原料中菌落總數(shù)的測(cè)定，也可用于檢測(cè)食品加工容器、操作臺(tái)和其他設(shè)備表面的菌落總數(shù)。第三十二頁(yè)，共41頁(yè)。使用方法菌落總數(shù)測(cè)試片的使用方法如圖：第三十三頁(yè)，共41頁(yè)。3操作方法3.1樣品處理。無(wú)菌稱取樣品25mL（g）放入含有225mL滅菌磷酸緩沖液稀釋液（或生理鹽水）的取樣罐或均質(zhì)杯內(nèi)，制成1:10的樣品勻液，必要時(shí)用1mol/LNaOH或1mol/L

HCl溶液調(diào)節(jié)樣品勻液pH至6.6～7.2。用1mL滅菌吸管吸取1:10樣品勻液1mL，注入含有9mL稀釋液的試管內(nèi)，振搖后成為1:100的樣品勻液，以此類推，做出1:1000等稀釋度的樣品勻液，每次換一支吸管。

3.2接種。一般食品選2～3個(gè)稀釋度進(jìn)行檢測(cè)，含菌量少的液體樣品（如飲用純水和礦泉水等）可直接吸取原液進(jìn)行檢測(cè)。將菌落總數(shù)測(cè)試片置于水平實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，揭開(kāi)上層膜，用無(wú)菌吸管吸取1mL樣品勻液慢慢均勻地滴加到紙片上，然后再將上層膜緩慢蓋下，靜置10s左右使培養(yǎng)基凝固，每個(gè)稀釋度接種兩片，同時(shí)做一片空白陰性對(duì)照。

3.3培養(yǎng)。將測(cè)試片疊在一起放回原自封袋中并封口，透明面朝上，水平置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，堆疊片數(shù)不超過(guò)12片。一般食品培養(yǎng)溫度為36℃±1℃，培養(yǎng)15～24h；水產(chǎn)品培養(yǎng)溫度為30℃±1℃，培養(yǎng)48h。4結(jié)果判讀細(xì)菌在測(cè)試片上生長(zhǎng)后會(huì)顯示紅色斑點(diǎn)，選擇菌落數(shù)適中（30～300個(gè)）的測(cè)試片進(jìn)行計(jì)數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)后即為每毫升（或每克）樣品中所含的細(xì)菌菌落總數(shù)。第三十四頁(yè)，共41頁(yè)。7.2磷酸緩沖液稀釋液的配制與滅菌貯存液：稱取34.0g的磷酸二氫鉀溶于500mL蒸餾水中，用大約175mL的1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.2，用蒸餾水稀釋至1000mL后貯存于冰箱。稀釋液：取貯存液1.25mL，用蒸餾水稀釋至1000mL，分裝于適宜容器中，121