蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)構(gòu)第1頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二蛋白質(zhì)（Protein）1838年，J.J.Berzelius提出，由西臘文proteuo衍生而來——第一重要，首要的物質(zhì)第2頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二蛋白質(zhì)存在于所有生物細(xì)胞中，是構(gòu)成生物體最基本的結(jié)構(gòu)物質(zhì)和功能物質(zhì)。蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，參與了幾乎所有的生命活動(dòng)過程。第3頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二（一）、蛋白質(zhì)功能的多樣性1.催化功能-酶2.調(diào)節(jié)功能-激素、基因調(diào)控因子3.轉(zhuǎn)運(yùn)功能-膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、血紅/血清蛋白4.貯存功能-乳、蛋、谷蛋白5.運(yùn)動(dòng)功能-鞭毛、肌肉蛋白6.結(jié)構(gòu)成分-皮、毛、骨、牙、細(xì)胞骨架7.支架作用-接頭蛋白8.防御功能-免疫球蛋白9.異常功能第4頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二二、蛋白質(zhì)通論（一）、蛋白質(zhì)的化學(xué)組成和分類１、元素組成第5頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二第6頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二２、蛋白質(zhì)的含氮量蛋白氮占生物組織所有含氮物質(zhì)的絕大部分。大多數(shù)蛋白質(zhì)含氮量接近于16%

蛋白質(zhì)含量=每克樣品中含氮的克數(shù)6.25凱氏定氮法第7頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二３、蛋白質(zhì)的分類（1）、依據(jù)外形分類球狀蛋白質(zhì)：globularprotein

纖維狀蛋白質(zhì)：fibrousprotein

膜蛋白質(zhì)：membraneprotein

第8頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二（2）、依據(jù)蛋白質(zhì)的組成分類簡(jiǎn)單蛋白

simpleprotein

單純蛋白，僅由氨基酸組成結(jié)合蛋白

conjugatedprotein由簡(jiǎn)單蛋白與其它非蛋白成分結(jié)合而成第9頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二簡(jiǎn)

單

蛋

白清蛋白和球蛋白albuminandglobulin

廣泛存在于動(dòng)物組織谷蛋白和醇溶谷蛋白glutelinandprolamin

植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸/堿精蛋白和組蛋白堿性蛋白存在于細(xì)胞核硬蛋白

第10頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二結(jié)

合

蛋

白色蛋白：簡(jiǎn)單蛋白+色素物質(zhì)糖蛋白：簡(jiǎn)單蛋白+糖類物質(zhì)脂蛋白：簡(jiǎn)單蛋白+脂類結(jié)合核蛋白：簡(jiǎn)單蛋白+核酸第11頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二N端C端按照蛋白質(zhì)的多肽鏈的組成分類有些蛋白質(zhì)是由兩條或多條多肽鏈構(gòu)成,這樣的蛋白質(zhì)稱為寡聚蛋白質(zhì)或者多聚蛋白質(zhì),其中每條多肽鏈稱為亞基.如:血紅蛋白.有些蛋白質(zhì)僅由一條多肽鏈構(gòu)成,稱為單體蛋白質(zhì),如溶菌酶.第12頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二（二）、蛋白質(zhì)的大小與分子量蛋白質(zhì)是分子量很大的生物分子對(duì)任一種給定的蛋白質(zhì)，其所有分子在AA組成和順序以及肽鏈的長(zhǎng)度方面都應(yīng)是相同的，即所謂均一的蛋白質(zhì)。第13頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二

蛋白質(zhì)與多肽無嚴(yán)格的界線——通常將6000Dr以上的多肽稱為蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子量變化范圍很大

對(duì)于不含輔基的蛋白質(zhì),用分子量除于氨基酸殘基的平均分子量110,即可以粗略估計(jì)該蛋白質(zhì)中氨基酸殘基的數(shù)目第14頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)包括

一級(jí)結(jié)構(gòu)(primarystructure)二級(jí)結(jié)構(gòu)(secondarystructure)三級(jí)結(jié)構(gòu)(tertiarystructure)四級(jí)結(jié)構(gòu)(quaternarystructure)（三）蛋白質(zhì)構(gòu)象和結(jié)構(gòu)的組織層次第15頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二定義蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)指多肽鏈中氨基酸的排列順序。(一)、蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)(Primarystructure）主要的化學(xué)鍵肽鍵，有些蛋白質(zhì)還包括二硫鍵。（三）蛋白質(zhì)構(gòu)象和結(jié)構(gòu)的組織層次第16頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二一級(jí)結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)空間構(gòu)象和特異生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。第17頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二(二)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子中某一段肽鏈的局部空間結(jié)構(gòu)，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相對(duì)空間位置，并不涉及氨基酸殘基側(cè)鏈的構(gòu)象

。定義

主要的化學(xué)鍵：

氫鍵

（三）蛋白質(zhì)構(gòu)象和結(jié)構(gòu)的組織層次第18頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二2.-折疊1.-螺旋第19頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二3.-轉(zhuǎn)角4.無規(guī)卷曲第20頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二三、蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)疏水鍵、離子鍵、氫鍵和VanderWaals力等。主要的化學(xué)鍵整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對(duì)空間位置。即肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置。（一）定義（三）蛋白質(zhì)構(gòu)象和結(jié)構(gòu)的組織層次第21頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二龍蝦素第22頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二木瓜蛋白酶組織蛋白酶第23頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二雞半胱氨酸蛋白酶抑制劑第24頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二亞基之間的結(jié)合力主要是疏水作用，其次是氫鍵和離子鍵。四、蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子中各亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用，稱為蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。有些蛋白質(zhì)分子含有二條或多條多肽鏈，每一條多肽鏈都有完整的三級(jí)結(jié)構(gòu)，稱為蛋白質(zhì)的亞基(subunit)。第25頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二血紅蛋白的四級(jí)結(jié)構(gòu)

第26頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二二、肽（peptide）AA-NH2與另一AA-COOH間失水形成的酰胺鍵稱肽鍵，所形成的化合物稱肽。第27頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二+-HOH甘氨酰甘氨酸肽鍵第28頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二由兩個(gè)AA組成的肽稱為二肽。由多個(gè)AA組成的肽則稱為多肽。組成多肽的AA單元稱為氨基酸殘基。第29頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二多肽鏈中AA殘基按一定順序排列：氨基酸順序含游離-氨基的一端：氨基端或N-端含游離-羧基的一端：羧基端或C-端AA順序是從N-端開始以C-端氨基酸殘基為終點(diǎn)如上述五肽：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln第30頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二（一）、肽和肽鍵的結(jié)構(gòu)第31頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二①肽鍵中C-N鍵有部分雙鍵性質(zhì)

——不能自由旋轉(zhuǎn)②組成肽鍵原子處于同一平面（肽平面）③鍵長(zhǎng)及鍵角一定④大多數(shù)情況以反式結(jié)構(gòu)存在第32頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二（一）肽單元參與肽鍵的6個(gè)原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，C1和C2在平面上所處的位置為反式(trans)構(gòu)型，此同一平面上的6個(gè)原子構(gòu)成了所謂的肽單元

(peptideunit)

。第33頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二共價(jià)主鏈

第34頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二（二）、肽的物理化學(xué)性質(zhì)肽末端α-羧基pKa值比游離AA中的大。肽末端α-氨基pKa值比游離AA中的小。等電點(diǎn)（兩性）。酸堿性質(zhì)取決于：—α-羧基、α-氨基、側(cè)鏈基團(tuán)的解離

具有雙縮脲反應(yīng)——Pr特有的反應(yīng)。第35頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二（三）、天然存在的重要多肽第36頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二第37頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二第38頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二

谷胱甘肽(glutathione,GSH)第39頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二GSH過氧化物酶H2O22GSH2H2OGSSG

GSH還原酶NADPH+H+NADP+第40頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二三、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定什么是Pr的一級(jí)結(jié)構(gòu)？蛋白質(zhì)中氨基酸的排列順序。第41頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二第42頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二1.樣品必需純（>97%以上）2.知道蛋白質(zhì)的分子量3.知道蛋白質(zhì)由幾個(gè)亞基組成4.測(cè)定蛋白質(zhì)的AA組成并根據(jù)分子量計(jì)算每種AA的個(gè)數(shù)5.測(cè)定水解液中的氨量計(jì)算酰胺的含量前提第43頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略(1)測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目通過測(cè)定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關(guān)系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定第44頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略(2)

多肽鏈的拆分蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定第45頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略幾條多肽鏈借助非共價(jià)鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質(zhì)，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體。可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈(亞基)。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定第46頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略(3)

斷開二硫鍵在8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護(hù)生成的巰基，防止重新被氧化。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定第47頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二第48頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定(4)測(cè)定每條多肽鏈的AA組成，并計(jì)算出AA成分的分子比

第49頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二第50頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略(5)分析多肽鏈的N-末端和C-末端(6)多肽鏈斷裂成多個(gè)肽段采用兩/多種不同的斷裂方法將多肽斷裂成兩套或多套肽段，并將其分離。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定第51頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略(7)測(cè)定每個(gè)肽段的氨基酸順序蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定(8)確定肽段在多肽鏈中的次序利用兩/多套肽段的AA順序彼此間的交錯(cuò)重疊，拼湊出整條多肽鏈的AA順序。第52頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略(9)確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定第53頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二兩類多肽鏈末端氨基酸殘基：

N-端氨基酸

C-端氨基酸在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。（二）、末端氨基酸殘基測(cè)定第54頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二Sanger法1、末端分析二硝基氟苯（DNFB）法O2NFNO2+

H2NCHCROHNCHCROO2NNO2H+H2OO2NNO2HNCHCROOH+氨基酸DNFBN-端氨基酸DNP衍生物DNP-氨基酸（二）、末端氨基酸殘基的鑒定N堿性條件二硝基苯衍生物黃色第55頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二二甲氨基萘磺酰-AA有強(qiáng)熒光，檢測(cè)靈敏度高丹磺酰氯（DNS）法（二）、末端氨基酸殘基的鑒定、末端分析1N(DNS-aa)第56頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二④苯異硫氰酸酯（PITC)法（二）、末端氨基酸殘基的鑒定、末端分析1N第57頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二—N=C=S+N—CH—COOHHHRPITC—N—C—N—CH—COOHHHRSPTC-氨基酸—N—CHRSNCCOPTH-氨基酸pH8.3無水HF苯異硫氰酸酯PITC第58頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二肽鏈外切酶:從多肽鏈N-端逐個(gè)向里水解根據(jù)不同反應(yīng)時(shí)間測(cè)出釋放的AA種類和數(shù)量，按反應(yīng)時(shí)間和AA殘基釋放量作動(dòng)力學(xué)曲線蛋白質(zhì)N-末端殘基順序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶

—水解以Leu殘基為N-末端的肽鍵速度最大。⑤氨肽酶法（二）、末端氨基酸殘基的鑒定、末端分析1N第59頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二肽鏈外切酶:從多肽鏈C-端逐個(gè)水解根據(jù)不同反應(yīng)時(shí)間釋放出的AA種類和數(shù)量蛋白質(zhì)C-末端殘基順序。四種羧肽酶：A,B,C和Y；A和B(胰臟)、C(柑桔葉)、Y(面包酵母)∽A:除Pro/Arg/Lys/外所有C-末端AA殘基∽B:只水解Arg和Lys為C-末端殘基的肽鍵

③羧肽酶法（二）、末端氨基酸殘基的鑒定、末端分析2C第60頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二（三）、二硫鍵的斷裂鹽酸胍/尿素解離多肽鏈間的非共價(jià)力。應(yīng)用過甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。第61頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二1、酸水解（四）、氨基酸組成的分析2、堿水解第62頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二1、酶解法:內(nèi)切酶：胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶外切酶：羧肽酶和氨肽酶多肽鏈的選擇性降解（五）、多肽鏈的部分裂解和肽段混合物的分離純化第63頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二R1=Lys（K）和Arg（R）專一性較強(qiáng)，水解速度快R2=Pro（抑制）肽鏈水解位點(diǎn)胰蛋白酶trypsin第64頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二R1=Phe（F）、Trp（W）Tyr（Y）等疏水性AALeu、Met和His稍慢R2=Pro（抑制）pH8-9肽鏈水解位點(diǎn)糜蛋白酶/胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）水解速度與相鄰AA性質(zhì)有關(guān):酸性：-/堿性：+第65頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二R2=Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、Leu（L）、Ile（I）、Met（M）、Val（V）及其它疏水性強(qiáng)的AA水解速度較快肽鏈水解位點(diǎn)R2=Pro或Gly，不水解R1或R3=Pro，抑制水解嗜熱菌蛋白酶（thermolysin)第66頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二R1和/或R2＝Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、Leu（L）及其它疏水性AA水解速度較快R1=Pro（抑制）pH2肽鏈水解位點(diǎn)胃蛋白酶Pepsin第67頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二肽鏈水解位點(diǎn)羧肽酶和氨肽酶第68頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二2、化學(xué)裂解法

①溴化氰水解法(Cyanogenbromide)——選擇性地切割由Met羧基形成的肽鍵。（五）、多肽鏈的部分裂解和肽段混合物的分離純化多肽鏈的選擇性降解第69頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二②NH2OH斷裂：較專一性斷裂Asn-Gly之間的肽鍵

Asn-Leu及Asn-Ala鍵也能部分?jǐn)嗔?/p>

第70頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二3、肽段的分離純化：

凝膠過濾、凝膠電泳和HPLC法第71頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二N-端分析法

特點(diǎn)：能夠不斷重復(fù)循環(huán)，將肽鏈N-端氨基酸殘基逐一進(jìn)行標(biāo)記和解離。

1、Edman法（六）、肽段氨基酸序列的測(cè)定（苯異硫氰酸酯法）Edman于1950年首先提出。第72頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二PITCPTC-肽第73頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二2、氨肽酶法或羧肽酶法3、質(zhì)譜法（MS）

靈敏度高、所需樣品少、測(cè)定速度快第74頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二第75頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二第76頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二第77頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二第78頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二核糖體蛋白質(zhì)鏈4.根據(jù)核苷酸序列的推定法第79頁，共88頁，2023年，2月20日，星期二（七）、肽