全國職業(yè)院校檢驗檢疫技術(shù)技能競賽微生物學(xué)檢驗-革蘭染色及細菌分區(qū)（四區(qū)）劃線試卷（高職組、本科組）一、競賽說明1.主要考核醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)專業(yè)、衛(wèi)生檢驗與檢疫技術(shù)專業(yè)學(xué)生對革蘭染色、分區(qū)劃線的熟練程度，在規(guī)定時間內(nèi)完成革蘭染色和細菌分區(qū)（四區(qū)）劃線的操作。2.本題滿分100分，完成時間22分鐘，其中細菌分區(qū)劃線6分鐘，革蘭染色16分鐘。3.獨立完成，不得相互詢問或討論。4.考核成績?yōu)椴僮鬟^程評分、操作結(jié)果和考核時間評分、職業(yè)素養(yǎng)之和。5.全部操作過程時間和操作后處理時間計入時間限額，超過規(guī)定時間將終止操作。二、實驗原理1.細菌分區(qū)（四區(qū)）劃線是將微生物樣品在固體培養(yǎng)基表面多次作“由點到線”稀釋而達到分離的目的。2.革蘭染色G＋菌：細胞壁結(jié)構(gòu)較致密，肽聚糖層厚，脂質(zhì)少，乙醇脫色時不易滲入菌體，并能使細胞壁脫水，間隙縮小，通透性下降，阻止結(jié)晶紫-碘復(fù)合物從胞內(nèi)滲出，保留紫色。G－菌：細胞壁結(jié)構(gòu)較疏松，肽聚糖層薄，脂質(zhì)多，易被乙醇溶解，使細胞壁通透性增高，菌體內(nèi)的結(jié)晶紫-碘復(fù)合物易被乙醇溶解逸出而脫掉紫色，經(jīng)沙黃或稀釋石碳酸復(fù)紅復(fù)染后呈紅色。三、實驗器材和試劑1.分區(qū)（四區(qū)）劃線法標(biāo)本（7cm血平板培養(yǎng)物）、9cm血平板、記號筆、不干膠標(biāo)簽（約2×3厘米方形）、生物安全柜、接種環(huán)、試管架、計時器、恒溫培養(yǎng)箱等。2.革蘭染色載玻片、試管架、紅藍鉛筆、接種環(huán)、記號筆、酒精燈、打火機、生理鹽水、吸水紙、沖洗瓶、計時器、紗布（可用于拭擦玻片）、顯微鏡、香柏油、擦鏡紙、擦鏡液、染色盤、染色架、消毒洗手液、洗面盆、抹布、銳器盒、普通污物缸、廢液缸、標(biāo)本盒等。3.實驗試劑革蘭氏染液（杭州濱和微生物試劑有限公司）：結(jié)晶紫染液、碘液、脫色液（95%乙醇）、復(fù)染液。(連包裝盒一起存放在上述托盤里，由選手取出使用，操作完畢后放回原位。)四、實驗標(biāo)本7cm血平板細菌培養(yǎng)物五、操作步驟1.細菌分區(qū)（四區(qū)）劃線法（1）標(biāo)記在9cm平板底部粘貼上不干膠標(biāo)簽，并用簽字筆在標(biāo)簽上正確標(biāo)記。（2）取菌右手持接種環(huán)（執(zhí)筆式）伸入紅外線滅菌器腔內(nèi)6～8秒，外移接種環(huán)，離開紅外線滅菌器內(nèi)腔，待冷卻后挑取少許標(biāo)本。（3）劃線左手持瓊脂平板適當(dāng)傾斜，用拇指打開皿蓋，使其與皿底間分開2～3cm寬的縫隙，右手持取標(biāo)本的接種環(huán)深入皿內(nèi)，先將細菌標(biāo)本在培養(yǎng)基一角涂成直徑約一厘米薄膜，并以此為起點，使接種環(huán)與接種平板面呈30°～40°角，以腕力在平板表面進行，連續(xù)不重疊劃線，作為第一區(qū)，其范圍不能超過平板的1/4；滅菌接種環(huán)，待冷卻后，轉(zhuǎn)動平皿至適合操作的位置（各區(qū)的交角應(yīng)為120°左右，即平板轉(zhuǎn)動一定角度約60°，以便充分利用整個平板的面積），將接種環(huán)通過第一區(qū)3～4次，連續(xù)不重疊劃線，作為第二區(qū)。同法依次劃完第三、四區(qū)，第四區(qū)切勿重新接觸第一、二區(qū)。注意每區(qū)的劃線須有數(shù)條線與上區(qū)交叉接觸，每區(qū)線間需保持一定距離，線條要密而不重復(fù)；劃第三至第四區(qū)間可不滅菌接種環(huán)。（4）培養(yǎng)劃線完畢，蓋好皿蓋，倒置放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h。（5）觀察結(jié)果培養(yǎng)18～24h后，從恒溫培養(yǎng)箱中取出，觀察菌落生長情況并計數(shù)單個菌落數(shù)量。2.革蘭染色（1）標(biāo)記選擇玻片并正確編號。（2）涂片用滅菌接種環(huán)挑取菌落與載玻片上預(yù)先滴加的生理鹽水涂布成1cm2或蠶豆大小的均勻半透明菌膜。（3）干燥涂片制成后，在空氣中使其迅速干燥，以免菌體皺縮變形（若需加快干燥速度，將涂布面朝上，置于火焰上方，不燙手的位置，慢慢烘干，切勿緊貼火焰）。（4）固定玻片干燥后用火焰加熱法固定，即玻片（菌膜面向上）以中速（鐘擺速度）來回通過火焰外焰3次進行固定，以玻片反面接觸手背皮膚，熱而不燙為宜。（5）初染加結(jié)晶紫染液，染60秒，細流水沖洗，并倒去玻片上積水。（6）媒染加碘液，染60秒，細流水沖洗，倒去玻片上積水。（7）脫色加脫色液，脫色10～30秒，不時搖動至無紫色逸出為止，細流水沖洗，倒去玻片上積水。（8）復(fù)染加復(fù)染液，染30～60秒，細流水沖洗，倒去玻片上積水。（9）鏡檢待已染色的細菌標(biāo)本片自然干燥或用吸水紙吸干后，再用顯微鏡進行觀察。

全國職業(yè)院校檢驗檢疫技術(shù)技能競賽微生物學(xué)檢驗-革蘭染色和細菌（四區(qū)）分區(qū)劃線答題卷（高職組、本科組）一、革蘭染色結(jié)果1.繪出鏡下形態(tài)2．鏡下結(jié)果描述參賽