NCBI常用功能與引物設(shè)計(jì)2010級博士：謝鵬

導(dǎo)師：鄒曉庭現(xiàn)在是1頁\一共有38頁\編輯于星期一為何要接觸NCBI？如何使用NCBI？如何設(shè)計(jì)引物？Yoursitehere現(xiàn)在是2頁\一共有38頁\編輯于星期一NCBI簡介NCBI：NationalCenterforBiotechnologyInformation美國國家信息技術(shù)中心（/）1992年10月，NCBI承擔(dān)起對GenBankDNA序列數(shù)據(jù)庫的責(zé)任。NCBI工作人員通過來自各個(gè)實(shí)驗(yàn)室遞交的序列和同國際核酸序列數(shù)據(jù)庫（EMBL和DDBJ）交換數(shù)據(jù)建立起數(shù)據(jù)庫.Genebank是遺傳序列數(shù)據(jù)庫，一個(gè)所有可以公開獲得的DNA序列的注釋過的收集。GenBank以指數(shù)形式增長，核酸堿基數(shù)目大概每14個(gè)月就翻一個(gè)倍。最近，GenBank擁有來自47,000個(gè)物種的30億個(gè)堿基。Yoursitehere現(xiàn)在是3頁\一共有38頁\編輯于星期一SubtitleYoursitehere現(xiàn)在是4頁\一共有38頁\編輯于星期一NCBI常用功能查找核酸/氨基酸序列序列相似性分析引物驗(yàn)證Yoursitehere現(xiàn)在是5頁\一共有38頁\編輯于星期一一、查找核酸、氨基酸序列1.以雞FAT/CD36為例，search：2.調(diào)整右側(cè)檢索目錄，tree--list：Yoursitehere現(xiàn)在是6頁\一共有38頁\編輯于星期一3.瀏覽信息，下載序列，并以Genebank、FASTA格式保存點(diǎn)擊Genebank:Yoursitehere現(xiàn)在是7頁\一共有38頁\編輯于星期一氨基酸序列：Genebank核酸序列：……FASTA格式的核酸序列：……Yoursitehere現(xiàn)在是8頁\一共有38頁\編輯于星期一二、序列相似性分析序列相似性分析：

就是將待研究序列與DNA或蛋白質(zhì)序列庫進(jìn)行比較，用于確定該序列的生物屬性，也就是找出與此序列相似的已知序列是什么。完成這一工作只需要使用兩兩序列比較算法。常用的程序包有BLAST、FASTA等序列同源性分析：是將待研究序列加入到一組與之同源，但來自不同物種的序列中進(jìn)行多序列同時(shí)比較，以確定該序列與其它序列間的同源性大小。這是理論分析方法中最關(guān)鍵的一步。完成這一工作必須使用多序列比較算法。常用的程序包有DNAMAN、CLUSTAL等Yoursitehere現(xiàn)在是9頁\一共有38頁\編輯于星期一Blast簡介

BLAST：“局部相似性基本查詢工具”(BasicLocalAlignmentSearchTool)的縮寫，是由NCBI開發(fā)的一個(gè)基于序列相似性的數(shù)據(jù)庫搜索程序。程序名查詢序列數(shù)據(jù)庫搜索方法Blastn核酸核酸核酸序列搜索逐一核酸數(shù)據(jù)庫中的序列Blastp蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)序列搜索逐一蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的序列Blastx核酸蛋白質(zhì)核酸序列6框翻譯成蛋白質(zhì)序列后和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的序列逐一搜索。Tblastn蛋白質(zhì)核酸蛋白質(zhì)序列和核酸數(shù)據(jù)庫中的核酸序列6框翻譯后的蛋白質(zhì)序列逐一比對。TBlastx核酸核酸核酸序列6框翻譯成蛋白質(zhì)序列，再和核酸數(shù)據(jù)庫中的核酸序列6框翻譯成的蛋白質(zhì)序列逐一進(jìn)行比對。主要的Blast程序：Yoursitehere現(xiàn)在是10頁\一共有38頁\編輯于星期一Blast序列相似性分析1.修改測序結(jié)果，剔除克隆載體序列在測序結(jié)果中找到上下游引物對應(yīng)位置，剔除引物外的多余部分以鴿子的I-FABP片段為例：GCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTAGGAAGTTAGGAGCCCACGATAATCTGAAGATCACTATTCAACAAGATGGAAACAAATTTACGGTCAAAGAATCAAGCAACTTCCGTACTATAGATATTGAATTCACTCTGGGAGTCAATTTTGACTACAGTCTCGCTGACGGAACGGAAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGT……上游引物：5‘-AGRAARYTDGSAGCYCAC-3’下游引物：5‘-

TCHGTYCCRTCWGCBAGA-3‘TAGGAAGTTAGGAGCCCACGATAATCTGAAGATCACTATTCAACAAGATGGAAACAAATTTACGGTCAAAGAATCAAGCAACTTCCGTACTATAGATATTGAATTCACTCTGGGAGTCAATTTTGACTACAGTCTCGCTGACGGAACGGAYoursitehere現(xiàn)在是11頁\一共有38頁\編輯于星期一2.進(jìn)入NCBI3.點(diǎn)擊BasicBLAST中的nucleotideblast選項(xiàng)Yoursitehere現(xiàn)在是12頁\一共有38頁\編輯于星期一Yoursitehere現(xiàn)在是13頁\一共有38頁\編輯于星期一Yoursitehere現(xiàn)在是14頁\一共有38頁\編輯于星期一4.尋找相近物種，比較相似性Yoursitehere現(xiàn)在是15頁\一共有38頁\編輯于星期一點(diǎn)擊score，獲得相似性比較具體信息NCBI官方說明：/BLAST/tutorial/Altschul-1.htmlYoursitehere現(xiàn)在是16頁\一共有38頁\編輯于星期一引物設(shè)計(jì)與簡并PCRRT－PCR原理與技術(shù)簡介引物設(shè)計(jì)過程簡并PCR技術(shù)后續(xù)研究Yoursitehere現(xiàn)在是17頁\一共有38頁\編輯于星期一RT－PCR原理與技術(shù)簡介DNAmRNA蛋白質(zhì)酶活力WesternblotNorthernblot半定量RTPCR定量RTPCRYoursitehere現(xiàn)在是18頁\一共有38頁\編輯于星期一RT－PCR原理與技術(shù)簡介

12Yoursitehere現(xiàn)在是19頁\一共有38頁\編輯于星期一常規(guī)引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)原則Primer5和Oligo6進(jìn)行引物分析Yoursitehere現(xiàn)在是20頁\一共有38頁\編輯于星期一引物設(shè)計(jì)原則

引物的長度一般為15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因?yàn)檫^長會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，即Taq酶的最適溫度。引物3’端的序列要比5’端重要。引物3’端的堿基一般不用A，因?yàn)锳在錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)的引發(fā)效率相對比較高。另外引物間3’端的互補(bǔ)、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。5’端序列對PCR影響不大。引物的GC含量一般為40-60%，以45-55％為宜，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。PCR引物的GC/AT比率應(yīng)當(dāng)?shù)扔诨蚋哂谒糯蟮哪０宓腉C/AT比。ΔG值(自由能)反映引物與模板結(jié)合的強(qiáng)弱程度。一般情況下，引物的ΔG值最好呈正弦曲線形狀，即5’端和中間ΔG值較高，而3’端ΔG值相對較低，且不要超過9（ΔG值為負(fù)值，這里取絕對值）。

引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能量一般不要超過4.5，否則容易產(chǎn)生引物二聚體帶。

Yoursitehere現(xiàn)在是21頁\一共有38頁\編輯于星期一以雞的I-FABP為例，設(shè)計(jì)常規(guī)引物：1.輸入I-FABP的已知序列，點(diǎn)擊primer:Yoursitehere現(xiàn)在是22頁\一共有38頁\編輯于星期一2.點(diǎn)擊search進(jìn)行引物條件設(shè)置：3.Searchcriteria篩選Yoursitehere現(xiàn)在是23頁\一共有38頁\編輯于星期一4.選擇最優(yōu)引物5.手動(dòng)修改，調(diào)整引物Yoursitehere現(xiàn)在是24頁\一共有38頁\編輯于星期一Blast引物驗(yàn)證最為重要的環(huán)節(jié)：對自己設(shè)計(jì)的引物或文獻(xiàn)報(bào)道的引物進(jìn)行測試1.登陸NCBI——Blast——Primer-BLAST:/Yoursitehere現(xiàn)在是25頁\一共有38頁\編輯于星期一以文獻(xiàn)報(bào)道雞的MUC2的引物為例：Yoursitehere現(xiàn)在是26頁\一共有38頁\編輯于星期一Yoursitehere現(xiàn)在是27頁\一共有38頁\編輯于星期一Yoursitehere現(xiàn)在是28頁\一共有38頁\編輯于星期一簡并引物設(shè)計(jì)Moreofanartthanascience降低簡并度（500以下）例如：上游DYNLFDLL下游PVNGNGKQ根據(jù)密碼子表建立引物系列http://www.kazusa.or.jp/codon/謹(jǐn)慎使用次黃嘌呤

GAYTAYAAYYTNTTYGAYYTNYTNCCNGTNAAYGGNAAYGGNAARCARSymbolDefinitionBnotADnotCHnotGIInosineKGorT/UMAorCNA,C,GorT/URAorGSCorGVnotT/UWAorTYCorT/U簡并引物：在常規(guī)引物的某些位點(diǎn)上以簡并核苷酸代替。Yoursitehere現(xiàn)在是29頁\一共有38頁\編輯于星期一簡并引物設(shè)計(jì)過程傳統(tǒng)方法（適用于保守度高序列）應(yīng)用BLAST進(jìn)行同源序列搜索應(yīng)用DNAMAN選擇保守區(qū)域（氨基酸或核苷酸）簡并引物設(shè)計(jì)原則Primer5和Oligo6進(jìn)行引物分析CODEHOP法（適用于保守度低序列）Yoursitehere現(xiàn)在是30頁\一共有38頁\編輯于星期一應(yīng)用BLAST進(jìn)行同源序列搜索剪切然后粘貼DNA或蛋白序列；使用FASTA格式的序列；FASTA格式的序列以一個(gè)單行的說明開始，說明行以其開始處的一個(gè)大于號（>）與序列數(shù)據(jù)區(qū)分開。說明行以下是序列數(shù)據(jù)。簡單使用訪問編號：RefSeq或Genebank序號。

/Yoursitehere現(xiàn)在是31頁\一共有38頁\編輯于星期一Yoursitehere現(xiàn)在是32頁\一共有38頁\編輯于星期一DNAMAN分析序列保守區(qū)對Gallus、Taeniopygia、Mus、Ruttus的I-FABP的CDS進(jìn)行分析得到保守區(qū)序列Yoursitehere現(xiàn)在是33頁\一共有38頁\編輯于星期一CODEHOP原理方法：http://bioinformatics.weizmann.ac.il/blocks/codehop.htmlYoursitehere現(xiàn)在是34頁\一共有38頁\編輯于星期一簡并PCR技術(shù)RNAcDNAcDNA反轉(zhuǎn)錄合并產(chǎn)物分裝產(chǎn)物β-actin樣品PCRYoursitehere現(xiàn)在是35頁\一共有38頁\編輯于星期一簡并PCR技術(shù)使用標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)體系并適當(dāng)增大引物濃度（1-3μM）退火溫度是最關(guān)鍵點(diǎn)：