支原體雙相培養(yǎng)法在泌尿生殖道分泌物檢測的臨床應(yīng)用及評價(jià)

Summary：目的：通過支原體雙相培養(yǎng)即固體和液體同時(shí)接種樣本培養(yǎng)的方法，探討其用于診斷Uu和Mh感染的臨床運(yùn)用價(jià)值，為后續(xù)臨床應(yīng)用提供依據(jù)。方法：對760例隨機(jī)泌尿生殖道分泌物樣本同時(shí)接種支原體固體和液體培養(yǎng)基，對相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并對臨床應(yīng)用效果進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果：760例樣本共分離出Uu285例陽性率37.5%，Mh97例陽性率12.8%，其中Uu+Mh有26例，總體陽性率為50.3%。其中有13例液體培養(yǎng)陽性樣本，固體培養(yǎng)基未生長，經(jīng)過液體轉(zhuǎn)種固體培養(yǎng)基，均未觀察到菌落。結(jié)論：采用固體和液體結(jié)合培養(yǎng)的方式雖然提高了檢驗(yàn)成本，但固體培養(yǎng)降低了液體培養(yǎng)的假陽性，而液體培養(yǎng)提供固體培養(yǎng)不能提供的藥物敏感性，雙相培養(yǎng)法對泌尿生殖道支原體感染的檢測具有更高的敏感性和特異性，支原體雙相培養(yǎng)法可以在臨床推廣應(yīng)用。Keys：解脲脲原體；人型支原體；雙相培養(yǎng)；臨床應(yīng)用通訊作者：郭懷英單位：西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科支原體（mycoplasma）是細(xì)胞外生存的最小微生物，是一類缺乏細(xì)胞壁的原核細(xì)胞型微生物，大小一般在0.2-0.3μm之間，呈高度多形性，有球形、桿形、絲狀，分枝狀等多種態(tài)。支原體主要包括支原體屬和脲原體屬，其中解脲脲原體（Ureaplasmaurealyticum，Uu）和人型支原體（mycoplasmahomins，MH）是泌尿生殖道非淋菌性炎癥中的最常見的病原體，與慢性前列腺炎、宮頸炎、陰道炎有著密切關(guān)系，是導(dǎo)致男女不孕不育的重要原因之一[1]。因此，準(zhǔn)確檢測Uu和Mh對臨床診斷和治療具有重要的指導(dǎo)意義。分離培養(yǎng)出病原體是診斷臨床病原體感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”。目前臨床實(shí)驗(yàn)室對Uu和Mh的分離培養(yǎng)，主要采用Uu和（或）Mh液體培養(yǎng)基，經(jīng)24-48h培養(yǎng)后通過液體變色來判斷。實(shí)際上，采用這種液體培養(yǎng)方法不能真正地分離培養(yǎng)出支原體，而只是通過添加不同底物進(jìn)行生化反應(yīng)而間接判斷結(jié)果，有假陽性結(jié)果，且存在較為嚴(yán)重的污染問題[1-2]。此外，支原體熒光定量PCR法檢測臨床生殖道樣本中支原體具有快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)，但受實(shí)驗(yàn)條件限制，影響其在實(shí)驗(yàn)室中開展[3]。Shepard等學(xué)者認(rèn)為，固體培養(yǎng)法是診斷標(biāo)本中有無支原體存在的最佳方法，尤其是固體培養(yǎng)基可以在低倍顯微鏡下直接觀察到支原體特有的典型“油煎蛋”樣菌落，是診斷支原體的可靠依據(jù)[4-6]。本報(bào)告旨在對分離解脲脲原體和人型支原體選擇性固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)相結(jié)合的方法進(jìn)行臨床評價(jià)。1、材料與方法1.1試劑Uu和Mh液體選擇分離培養(yǎng)基和固體選擇分離培養(yǎng)基均由眾愛生河北生物科技有限公司提供。1.2儀器二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo371，美國）、100μl定量移液器（Finnpipette，芬蘭）、顯微鏡（Olympus日本）。1.3臨床標(biāo)本所有患者于2020年1月1日至2021年6月30日來本院婦科、泌尿外科和皮膚科門診就診的支原體感染疑似患者，標(biāo)本含尿液、尿道或?qū)m頸分泌物、精液、前列腺液等，共760例，其中男性126例，女性634例，年齡最小16歲，最大71歲，均由醫(yī)生按試劑說明書要求用無菌拭子采集并立即送檢。1.4方法1.4.1標(biāo)本采集男性：清潔尿道口用無菌拭子取尿道口2.0-2.5cm分泌物或取尿沉渣（中段尿10-20ml，2000r/min離心10min）。

女性：取宮頸口內(nèi)1-2cm處分泌物，取樣前先用另一棉拭子拭凈宮頸口外的分泌物，采樣時(shí)拭子轉(zhuǎn)動(dòng)30s，取出時(shí)拭子不可碰到陰道壁，取樣后立即送檢。1.4.2標(biāo)本接種取出試劑盒復(fù)溫至室溫并編號，先從未接種樣本的培養(yǎng)瓶中取100μl的培養(yǎng)基液加入藥敏板陰性對照孔。將采集標(biāo)本拭子頭放在固體選擇分離培養(yǎng)基表面滾動(dòng)劃線接種后，再將拭子頭插入液體培養(yǎng)基液中，充分洗滌，在瓶壁上擠干拭子，定量移液器分別取100μl已接種的培養(yǎng)基液體標(biāo)本加在除陰性孔以外的各孔中。1.4.3培養(yǎng)固體選擇分離培養(yǎng)基每組套內(nèi)加一片CO2發(fā)生片（廠家配套），蓋上蓋。液體培養(yǎng)板每孔滴加1-2滴石蠟油，蓋上蓋。將剩下的培養(yǎng)基和藥敏板以及固體培養(yǎng)基放在35℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h、48h和72h分別觀察結(jié)果。1.5結(jié)果觀察1.5.1液體培養(yǎng)基觀察陰性對照孔：培養(yǎng)后應(yīng)為陰性，仍顯清亮黃色液體，只有陰性對照孔為陰性時(shí)，其他反應(yīng)結(jié)果才有意義,陽性對照孔：由黃色變成紅色，且無混濁為陽性，顯示有支原體生長。未由黃色變成紅色，且無混濁為陰性，顯示無支原體生長。如出現(xiàn)混濁則視為污染，結(jié)果無意義。觀察時(shí)間：在培養(yǎng)24-48-72h后每天上午、下午各觀察一次。結(jié)果判斷：Uu≥104孔為Uu鑒定孔，Mh≥104孔為Mh鑒定孔。當(dāng)陽性對照孔為陽性，Uu鑒定孔為陽性（培養(yǎng)24h，培養(yǎng)基由黃變紅、清亮無混濁），表示Uu計(jì)數(shù)（ccu≥104），有臨床意義，見圖1（左）。當(dāng)陽性對照孔為陽性，Mh鑒定孔為陽性（培養(yǎng)48h，培養(yǎng)基由黃變紅、清亮無混濁），表示Mh支原體計(jì)數(shù)（ccu≥104），有臨床意義，見圖3（左）。當(dāng)陽性對照孔為陽性，Uu鑒定孔和鑒定孔同時(shí)為陽性時(shí)，顯示Uu、Mh混合感染，見圖2（左）1.5.2固體培養(yǎng)基顯微鏡觀察：在培養(yǎng)24-48-72h后每天上午、下午各一次將固體培養(yǎng)基放在顯微鏡下（10×10）仔細(xì)觀察，找到典型Uu和或Mh菌落時(shí)可確認(rèn)為陽性。若液體培養(yǎng)液變紅，而固體培養(yǎng)基上無菌落，則從變色的液體培養(yǎng)液中吸取20μl，滴種在固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，下一次繼續(xù)觀察有無菌落生長。陽性結(jié)果包括Uu、Mh、Uu+Mh單純或混合感染。2、結(jié)果2.1液體法和固體法生殖道支原體分離培養(yǎng)結(jié)果760例可疑標(biāo)本中檢出Uu285例；Mh97例；其中Uu+Mh26例；全陰性378例（表1）。大約85%的支原體在24h內(nèi)可以觀察到菌落，48h內(nèi)固體和液體培養(yǎng)的陽性率幾乎沒有差別。表1760例標(biāo)本生殖道支原體分離培養(yǎng)結(jié)果液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基結(jié)果

例數(shù)結(jié)果

例數(shù)

變紅無渾濁（Uu）孔295Uu生長282變紅無渾濁（Mh）孔97Mh生長97變紅有渾濁(Uu+Mh)孔3Uu生長3未變紅365未生長378合計(jì)7607602.2Uu和Mh在固體和液體培養(yǎng)陽性結(jié)果菌落特點(diǎn)：Uu菌落在鏡下呈棕褐色顆粒、棕褐色菌線或棕褐色團(tuán)塊樣菌落（20-60μm），見圖1（右）；Mh菌落在鏡下典型的“油煎蛋”樣菌落（100-300μm），中間較厚，有寬大的外圍，見圖3（右）；二者菌落相比，Mh比Uu大數(shù)倍。液體培養(yǎng)基陽性對照孔變紅、Uu≥104孔變紅，圖1（左）,固體培養(yǎng)基鏡下見Uu棕褐色菌落（箭頭所示），圖1（右），提示Uu感染；液體培養(yǎng)基陽性對照孔變紅、Uu≥104孔和Mh≥104孔變紅，圖2（左），固體培養(yǎng)基鏡下見Uu棕褐色菌落（箭頭所示）和Mh油煎蛋樣菌落（箭頭所示），圖2（右），提示Uu、Mh混合感染；液體培養(yǎng)基陽性對照孔變紅、Mh≥104孔變紅，圖3（左），固體培養(yǎng)基鏡下見油煎蛋樣菌落（箭頭所示），圖3（右），提示Mh感染；液體培養(yǎng)基陽性孔變紅且渾濁，Uu≥104孔變紅且渾濁，固體培養(yǎng)基鏡下觀察到Uu菌落，見圖4（左）提示有Uu和其他污染菌感染；液體培養(yǎng)基陰、陽性對照孔未變或變紅，Uu≥104孔變紅，圖4（右），固體培養(yǎng)基鏡下未見Uu菌落，提示Uu假陽性。圖1為Uu陽性，鏡下見Uu棕褐色菌落（箭頭所示）圖2為Uu+Mh陽性，鏡下見Uu和Mh菌落（箭頭所示）圖3為Mh陽性,鏡下見典型“油煎蛋”菌落（箭頭所示）圖4左為Uu假陰性，鏡下見Uu菌落；圖4右為Uu假陽性，鏡下未見菌落3.分析討論目前國內(nèi)臨床實(shí)驗(yàn)室對泌尿生殖道支原體檢測，除少數(shù)科研院校及大醫(yī)院是采用液體增菌加固體分離外，絕大部分醫(yī)療單位都是采用單純液體變色法檢測支原體。支原體在液體中生長有其不同于細(xì)菌的特點(diǎn)，因其個(gè)體微小，在增殖過程中不導(dǎo)致液體渾濁或生成沉淀，Uu分解尿素Mh分解精氨酸均生成胺，使液體培養(yǎng)基變堿，指示劑酚紅在培養(yǎng)基中顏色由黃變紅，所以臨床上常將液體培養(yǎng)基在培養(yǎng)48h內(nèi)變紅且澄清者判定為支原體生長陽性。液體變色法操作簡便，對儀器設(shè)備沒有特殊要求，所以廣受歡迎，多年來一直占據(jù)著支原體檢測的主導(dǎo)地位[7-8]。支原體液體培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中顏色變紅，僅是一種生化反應(yīng)，這種生化反應(yīng)并非支原體所特有，一旦標(biāo)本中混有其它能分解尿素或精氨酸產(chǎn)氨的微生物存在，又未能被培養(yǎng)基中抑菌劑所抑制，這些非目的菌就生長并使培養(yǎng)基變混，即使有支原體生長，培養(yǎng)基變紅，按照陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，也會(huì)誤斷為陰性。本次評價(jià)了760例標(biāo)本中固體培養(yǎng)檢出Uu282例、Mh97例、其中Uu+Mh22例，Uu和Mh陽性率50.3%；而液體培養(yǎng)檢出Uu295例、Mh97例、其中Uu+Mh22例，Uu和Mh陽性率為51.6%；在液體培養(yǎng)變紅13例中，經(jīng)過從變色的液體培養(yǎng)液中吸取20μl，滴種在固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)后，均未找到典型菌落，說明液體培養(yǎng)存在假陽性；而有3例液體培養(yǎng)陽性對照和Uu和Mh對照孔變紅且混濁，按照液體培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)判斷為陰性，但卻在固體培養(yǎng)基上找到了Uu菌落，說明液體培養(yǎng)也存在假陰性。3.1固體培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：固體培養(yǎng)具有液體培養(yǎng)無可取代的優(yōu)勢，其一是Uu和Mh菌落可在48h內(nèi)長出，菌落形態(tài)典型，不會(huì)出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果；其二是固體培養(yǎng)基污染少，即便有輕度污染也不會(huì)影響支原體生長和觀察；其三可以在固體培養(yǎng)基上同時(shí)鑒別多種支原體；其四標(biāo)本直接滾動(dòng)涂劃在瓊脂表面，操作簡便，鏡下觀察背景更清晰，利用劃痕很快找到瓊脂層面并在劃痕附近找到支原體菌落。3.2結(jié)果可靠：液體培養(yǎng)觀察鑒定和藥敏試驗(yàn)結(jié)果，再結(jié)合固體培養(yǎng)基在鏡下仔細(xì)觀察典型的Uu和Mh菌落形態(tài)，準(zhǔn)確性更高、24-48h出結(jié)果更快速，特異性好和選擇性強(qiáng)，杜絕了單獨(dú)使用液體培養(yǎng)所造成的假陰性和假陽性。3.3操作簡便：不需要特殊儀器。試劑盒提供的CO2發(fā)生片給沒有CO2培養(yǎng)箱的基層醫(yī)院提供了便利，可以在基層醫(yī)院推廣應(yīng)用。所以支原體雙相培養(yǎng)結(jié)合固體培養(yǎng)基上的典型菌落和液體培養(yǎng)的藥敏報(bào)告，為臨床醫(yī)生合理用藥提供有力的依據(jù)。4.Reference[1]汪洪,章杰,吳有才,王滌宇,陳圣軍.2009—2015年女性泌尿生殖道解脲支原體藥敏趨勢分析[J].安徽醫(yī)藥,2018,22(04):765-768.[2]鄺兆威,陳艷清,賈建,符宏建.固體培養(yǎng)法和液體培養(yǎng)法檢測在支原體感染診斷中效果分析[J].中國實(shí)用醫(yī)藥,2018,13(16):194-195.DOI:10.14163/ki.11-5547/r.2018.16.114.[3]倪紅霞,劉志輝,鄭學(xué)星,等.TaqMan探針熒光定量PCR支原體快速檢測方法的建立及應(yīng)用[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版,2010,36:797-802.[4]EkielA,PietrzakB,Wiechu00aB,etal.Urogenitalmycoplasmasandhumanpapillomavirusinhemodialysedwomen.[J].Thescientificworldjournal,2013,(11):378-387.[5]GdouraR,KchaouW,ChaariC,etal.Ureaplasmaurealyticum,Ureaplasmaparvum,MycoplasmahominisandMycoplasmagenitaliuminfectionsandsemenqualityofinfertilemen[J].BmcInfectiousDiseases,2007,7(17):1-9.[6]Shepard,M.C.,LuncefordC.D.Ureasecolortestmedi