質(zhì)粒的提取與鑒定第1頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日實(shí)驗(yàn)內(nèi)容提取原理操作步驟計(jì)算方法操作步驟質(zhì)粒DNA定量酶切原理酶切步驟酶切電泳原理電泳步驟電泳第2頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日2.質(zhì)粒DNA提取原理3.質(zhì)粒DNA操作步驟4.紫外檢測(cè)定量知識(shí)5.酶切原理、操作步驟6.瓊脂糖電泳原理及步驟7.凝膠成像系統(tǒng)質(zhì)粒DNA的提取酶切分析質(zhì)粒定量瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)流程第3頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆諌A裂解法提取質(zhì)粒的方法了解紫外吸收法檢測(cè)DNA濃度與純度的原理、方法學(xué)習(xí)水平式瓊脂糖凝膠電泳操作第4頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日第二部分質(zhì)粒DNA提取與定量ExtractionandQuantitationofPlasmidDNA第5頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日獨(dú)立于細(xì)菌染色替外，能獨(dú)立自主復(fù)制的閉合環(huán)狀DNA分子；存在于細(xì)菌，放線菌，真菌以及一些動(dòng)植物細(xì)胞中，在細(xì)菌細(xì)胞中最多．質(zhì)粒（Ｐl(wèi)asmid）定義

第6頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日堿裂解法煮沸裂解羥基磷灰石柱層析法質(zhì)粒DNA釋放法酸酚法等方法

選擇哪一種方法主要取決以下幾個(gè)因素：質(zhì)粒的大小大腸桿菌菌株裂解后用于純化的技術(shù)和實(shí)驗(yàn)要求第7頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日分離質(zhì)粒DNA的方法包括3個(gè)基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)菌；分離質(zhì)粒DNA分離質(zhì)粒DNA三步曲分離質(zhì)粒收集裂解細(xì)菌質(zhì)粒擴(kuò)增基本步驟

第8頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日基本原理

1、堿裂解法基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異；高堿性條件下，染色體DNA和質(zhì)粒DNA變性；當(dāng)以高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其pH值至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA復(fù)性并保存在溶液中，染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心形成沉定去除；第9頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日2、離心層析柱基本原理

硅基質(zhì)膜在高鹽、低pH值狀態(tài)下選擇性地結(jié)合溶液中的質(zhì)粒DNA；去蛋白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細(xì)菌成分去除；低鹽，高pH值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫；第10頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日☆原理示意圖第11頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日（一）儀器：恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、超凈工作臺(tái)、臺(tái)式離心機(jī)、高壓滅菌鍋（二）材料：含pMD18-T質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α（三）試劑：

LB培養(yǎng)基（液體、固體）Bioteke質(zhì)粒提取試劑盒（北京百泰克，中國(guó)）溶液P1溶液P2溶液P3去蛋白液PE漂洗液WB洗脫液EB儀器材料

第12頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris·Cl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)作用：分散細(xì)胞，鰲合金屬離子使金屬酶失活注意：菌液一定懸浮均勻，不能有結(jié)塊溶液I

第13頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日0.2mol/LNaOH1%SDS作用：細(xì)胞壁肽聚糖在堿性下水解，核酸和蛋白質(zhì)變性。注意：時(shí)間勿太久，動(dòng)作要溫柔，輕輕顛倒幾次溶液II

第14頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日5mol/L乙酸鉀60ml冰乙酸 11.5ml水 28.5ml作用：酸性條件下質(zhì)粒DNA復(fù)性，變性蛋白-SDS＋線性DNA沉淀，Na＋可中和DNA注意：復(fù)性時(shí)間不宜過長(zhǎng)溶液III

第15頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日菌液離心13000rpm,1min棄上清瞬時(shí)離心徹底棄上清加250μl溶液P1旋渦振蕩懸浮沉淀加250μl溶液P2加400μl

溶液P3顛倒數(shù)次放置3-5min離心13000rpm,10min取上700μl加到吸附柱中離心13000rpm,1min棄濾液，加入500μl去蛋白液13000rpm,1min離心（1）（2）（3）（4）（5）（6）（7）（8）（9）棄濾液，加入500μl漂洗液WB（10）離心13000rpm,1min棄濾液，加入500μl漂洗液WB（11）離心13000rpm,1min棄濾液（12）空柱離心13000rpm,2min放入一個(gè)干凈的離心管中(開蓋放置3min)，在吸附膜的中間加60μl洗脫液EB(放置1min)離心13000rpm,1min（13）-20℃保存?zhèn)溆貌僮鞑襟E

顛倒數(shù)次第16頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日

紫外光吸收法原理：1,物質(zhì)在光的照射下會(huì)產(chǎn)生對(duì)光的吸收效應(yīng)

2,而且物質(zhì)對(duì)光的吸收是具有選擇性的

3,各種不同的物質(zhì)都具有其各自的吸收光譜

因此不同波長(zhǎng)的單色光通過溶液時(shí)其光的能量就會(huì)被不同程度的吸收，光能量被吸收的程度和物質(zhì)的濃度有一定的比例關(guān)系.定量檢測(cè)

第17頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日計(jì)算方法:因?yàn)榻M成核酸的堿基(G,A,T,C）在260nm處具有強(qiáng)吸收峰，所以通過測(cè)定260nm的吸收峰即可對(duì)DNA進(jìn)行定量。dsDNA(雙鏈DNA)1A260=50ug/mlssDNA(單鏈DNA)1A260=33ug/mlRNA1A260=40ug/ml定量檢測(cè)

第18頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日記錄A260值，通過計(jì)算確定DNA濃度，公式如下:質(zhì)粒DNA(g/ml)=50×(A260)×稀釋倍數(shù)

注意:我們接下來要用的eppendorf公司生產(chǎn)的紫外分光光度計(jì),會(huì)根據(jù)樣品的稀釋倍數(shù)自動(dòng)算出質(zhì)粒DNA的最終濃度和Ratio值.

定量檢測(cè)

第19頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日根據(jù)在260nm以及在280nm的讀數(shù)比值估計(jì)核酸的純度（Ratio=A260/A280）Ratio=1.8DNA樣品較純,符合實(shí)驗(yàn)要求Ratio＞1.9RNA污染Ratio＜1.6

蛋白質(zhì)或其它雜質(zhì)的污染定量檢測(cè)

第20頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日實(shí)驗(yàn)儀器定量檢測(cè)

紫外分光光度計(jì)

比色杯

第21頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日數(shù)據(jù)處理測(cè)量次數(shù)質(zhì)粒DNA濃度(μg/mL)Ratio值(A260/A280)123平均值定量檢測(cè)

第22頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日定量檢測(cè)

第23頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日菌體老化堿裂解不充分菌體中無質(zhì)粒溶液使用不當(dāng)請(qǐng)涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)可減少菌體用量或增加溶液的用量不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時(shí)應(yīng)接種單菌落。檢查抗生素使用濃度是否正確。溶液Ⅱ在溫度較低時(shí)可能出現(xiàn)渾濁，置于37℃保溫片刻直至溶解為清亮的溶液。問題一：未提出質(zhì)?；蛸|(zhì)粒得率較低，如何解決？

原因?qū)Σ叱Ｒ妴栴}

第24頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日混有蛋白混有RNA混有基因組DNA不要使用過多菌體。重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)加入RNaseA室溫放置一段時(shí)間加入溶液II和III后防止劇烈振蕩，可能把基因組DNA剪切成碎片從而混雜在質(zhì)粒中。細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞和DNA的降解，培養(yǎng)時(shí)間不要超過16小時(shí)。問題二：質(zhì)粒純度不高，如何解決？

原因?qū)Σ叱Ｒ妴栴}

第25頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日第三部分酶切鑒定DNARestrictionEnzymeDigestion第26頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日限制性內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）是DNA操作過程中所使用的基本工具。特異性地結(jié)合于一段被稱為限制酶識(shí)別序列的特殊DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上，并在此切割雙鏈DNA。分子克隆中常用的為II類限制酶，其識(shí)別位點(diǎn)長(zhǎng)度為4、5或6個(gè)核苷酸的反向重復(fù)序列。限制性內(nèi)切酶

第27頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日限制酶的切割點(diǎn)因酶而異，有的在對(duì)稱軸處切割,

產(chǎn)生平末端的DNA片段,如HaeIII,有的切割位點(diǎn)在對(duì)稱軸一側(cè)，產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性末端，如EcoRⅠ.限制性內(nèi)切酶

第28頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日★平末端

在識(shí)別順序的中心對(duì)稱軸處切割5’G-G-C-C3’3’C-C-G-G5’5’G-G3’C-C-C-C3’-G-G5’HaeIII限制性內(nèi)切酶

第29頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日★3’端粘性末端

在識(shí)別順序的雙側(cè)末端切割DNA雙鏈，于對(duì)稱軸的3’末端切割。5’G-G-T-A-C-C3’3’C-C-A-T-G-G5’G-G-T-A-C3’CC3’C-A-T-G-GKpnI限制性內(nèi)切酶

第30頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日5’G-A-A-T-T-C3’3’C-T-T-A-A-G5’GC-T-T-A-A5’5’A-A-T-T-CGEcoRI★5’端粘性末端

在識(shí)別順序的雙側(cè)末端切割DNA雙鏈，于對(duì)稱軸的5’末端切割。5’A-A-G-C-T-T3’3’T-T-C-G-A-A5’AT-T-C-G-A5’5’A-G-C-T-TAHindIII限制性內(nèi)切酶

第31頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日雙酶切限制酶的選擇非常重要，盡量選擇粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，提前看好各公司的雙切酶所用公用的BUFFER如果有一種buffer能同時(shí)使2種酶的活力都超過70%的話，就可以用這種buffer作為反應(yīng)buffer；如果兩種酶廠家不同無法查時(shí)可比較其buffer成份，相似的話可以考慮各取一半中和；限制性內(nèi)切酶

第32頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日Buffer的選擇查閱內(nèi)切酶供應(yīng)商在目錄后的附錄中提供的各種酶在不同buffer中的活力表第33頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日

酶量的選擇任何時(shí)候2種酶的總量不能超過反應(yīng)體系的1/10體積，而且最大反應(yīng)體系最好不要小于20ul。以TAKARA的為例，其對(duì)1單位酶的定義如下：在50μl反應(yīng)液中，30℃溫度下反應(yīng)1小時(shí)，將1μg的λDNA完全分解的酶量定義為1個(gè)活性單位(U)。而該酶濃度約為15單位/微升，在除外酶降解的因素外該酶可分解15μg的DNA。限制性內(nèi)切酶

第34頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日插入400bpDNA片段質(zhì)粒大小為:2692bp+400bp=3092bp酶切片段大小為?酶切位點(diǎn)酶切位點(diǎn)第35頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日影響酶切反應(yīng)的因素

底物DNA的純度：主要污染DNA的某些物質(zhì)，如酚、氯仿、乙醇等均能抑制酶反應(yīng);反應(yīng)系統(tǒng)：主要是反應(yīng)緩沖液中的離子強(qiáng)度,如NaCl和Mg2+,合適離子強(qiáng)度可以激發(fā)酶切反應(yīng);

反應(yīng)體積：一般應(yīng)盡量小，且酶切反應(yīng)中甘油濃度應(yīng)低于5%;保溫時(shí)間與溫度：溫度改變會(huì)使酶識(shí)別錯(cuò)誤;限制性內(nèi)切酶

第36頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日試劑名稱體積(μL)無菌水6.010×M酶切緩沖液2.0質(zhì)粒DNA10.0HindIII(15U/ul)1.0EcoRI(12U/ul)1.0總體積20.0在一個(gè)潔凈的1.5mlEP管中按順序依次加入下述試劑移液槍輕輕混勻(避免產(chǎn)生氣泡),37℃水浴1h反應(yīng)體系

第37頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日第四部分瓊脂糖凝膠電泳DNAAgaroseGelElectrophoresis第38頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日天然瓊脂（Agar）是一種多聚糖，主要由瓊脂糖（Agarose，約占80％）及瓊脂膠（Agaropectin）組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷。瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強(qiáng)酸性多糖，由于這些基團(tuán)帶有電荷，在電場(chǎng)作用下能產(chǎn)生較強(qiáng)的電滲現(xiàn)象，加之硫酸根可與某些蛋白質(zhì)作用而影響電泳速度及分離效果。瓊脂糖透明無紫外吸收，因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進(jìn)行平板電泳。

定義

第39頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日瓊脂糖是一種天然聚合長(zhǎng)鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度DNA分子在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng).DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同的DNA，分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶(遷移速度與分子量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系).實(shí)驗(yàn)原理

第40頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日

1、DNA的分子大小

2、瓊脂糖濃度

3、DNA分子的構(gòu)象

4、電源電壓

5、嵌入染料的存在

6、離子強(qiáng)度影響

影響遷移速率因素

第41頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日分離范圍

第42頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日１.電泳指示劑：核酸電泳常用的指示劑有兩種，溴酚藍(lán)呈藍(lán)紫色；二甲苯晴呈藍(lán)色，它攜帶的電荷量比溴酚藍(lán)少，在凝膠中的的遷移率比溴酚藍(lán)慢。

２．Gelview３．TBE４．瓊脂糖5、DNAMarker5000實(shí)驗(yàn)材料

第43頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日溴化乙錠(EB)

:3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴鹽)，可與DNA結(jié)合,在紫外光照射下呈現(xiàn)紅橙熒光,有致癌性.Gelview:

是一種新型核酸染料,可與DNA分子形成復(fù)合物，能產(chǎn)生極強(qiáng)的熒光信號(hào)，其靈敏度比EB高,且熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比熒光,在紫外光照射下呈現(xiàn)綠色熒光.常用染料實(shí)驗(yàn)材料

第44頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日是分子量不同的DNA片段，主要用途就是DNA分子凝膠電泳時(shí)，加樣用做對(duì)比來檢測(cè)瓊脂糖凝膠是否有問題。DNAMarker

應(yīng)選擇在目