蛋白質(zhì)組學(xué)與分析技術(shù)

邱德文2010。3。241蛋白質(zhì)的分離純化方法（一）根據(jù)分子大小不同的純化方法

1、透析和超過濾利用蛋白質(zhì)分子不能透過半透膜將其與小分子物質(zhì)分開半透膜為玻璃紙或纖維素材料2利用溶解度差別的純化方法

1.等電點沉淀調(diào)整溶液pH

不同蛋白在各自pI處依次沉淀

2.鹽溶和鹽析3.有機(jī)溶劑分級分離法降低介電常數(shù)爭奪水化膜3聚丙烯酰胺凝膠電泳通過丙烯酰胺單體和N，N，-甲叉雙丙烯酰胺按一定比率混合，在有引發(fā)劑和增速劑存在下聚合形成交叉網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，丙烯酰胺單體聚合生成長鏈聚合物，甲叉雙丙烯酰胺的雙功能和鏈末端的自由功能基團(tuán)反應(yīng)，發(fā)生交聯(lián)，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)等電聚焦凝膠，按等電點不同分離蛋白質(zhì)，SDS按相對分子質(zhì)量大小分離蛋白質(zhì)5聚丙烯酰胺凝膠電泳通過丙烯酰胺單體和N，N，-甲叉雙丙烯酰胺按一定比率混合，在有引發(fā)劑和增速劑存在下聚合形成交叉網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，丙烯酰胺單體聚合生成長鏈聚合物，甲叉雙丙烯酰胺的雙功能和鏈末端的自由功能基團(tuán)反應(yīng)，發(fā)生交聯(lián)，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)等電聚焦凝膠，按等電點不同分離蛋白質(zhì)，SDS按相對分子質(zhì)量大小分離蛋白質(zhì)67雙向電泳9膠上蛋白的檢測蛋白質(zhì)檢測常用考馬斯亮藍(lán)染色銀染負(fù)染熒光標(biāo)記、同位素標(biāo)記，提高靈敏度和自動化水平10層析分離純化技術(shù)11131415171819層析分離技術(shù)(chromatography)

層析是廣泛使用的分離蛋白質(zhì)的方法，它是根據(jù)蛋白質(zhì)的形態(tài)、大小和電荷的不同而設(shè)計的物理分離方法。凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析等是目前最常用的層析方法。21凝膠過濾層析(gelfiltrationchromatography)凝膠過濾層析法又稱排阻層析或分子篩方法，主要是根據(jù)蛋白質(zhì)的大小和形狀，即蛋白質(zhì)的質(zhì)量進(jìn)行分離和純化。三種不同的蛋白質(zhì)根據(jù)它們大小的不同在層析柱中被分離。22親和層析(affinitychromatography)在生物分子中有些分子的特定結(jié)構(gòu)部位能夠同其他分子相互識別并結(jié)合，如酶與底物的識別結(jié)合、受體與配體的識別結(jié)合、抗體與抗原的識別結(jié)合，這種結(jié)合既是特異的，又是可逆的，改變條件可以使這種結(jié)合解除。生物分子間的這種結(jié)合能力稱為親和力。瓊脂糖珠的表面吸附劑(如胰島素配體)只能同特異的受體結(jié)合(胰島素)23柱層析分離常說的過柱子應(yīng)該叫柱層析分離，也叫柱色譜。我們常用的是以硅膠或氧化鋁作固定相的吸附柱。柱子可以分為：加壓，常壓，減壓。壓力可以增加淋洗劑的流動速度，減少產(chǎn)品收集的時間，但是會減低柱子的塔板數(shù)。所以其他條件相同的時候，常壓柱是效率最高的，但是時間也最長.減壓柱能夠減少硅膠的使用量，但是由于大量的空氣通過硅膠會使溶劑揮發(fā)，以前曾經(jīng)大量的過減壓柱，但是自從嘗試了加壓后，就很少使用減壓柱色譜了。

25蛋白質(zhì)分析制備儀26高效純化策略粗提純化精細(xì)純化載量速度分辯率回收率29準(zhǔn)備工作

考慮:純度水平需要量保持生物活性有效和經(jīng)濟(jì)蛋白質(zhì)特性:穩(wěn)定性-pH-離子強(qiáng)度-溫度分子量等電點30pH的重要性:蛋白質(zhì)凈電荷隨pH改變滴定曲線蛋白質(zhì)凈電荷1210穩(wěn)定性范圍用陽離子交換用陰離子交換3pH不同pH下的分離情況21+-31pH的重要性:蛋白質(zhì)凈電荷隨pH改變流動相的pH選擇性VVV陽離子陰離子pH0+-VVVVVAbsAbsAbsAbs表面凈電荷Abs

Abs

Abs

Abs32樣品準(zhǔn)備考慮:根據(jù)蛋白質(zhì)來源選擇不同萃取方法使用溫和的步驟減少酸化和釋放蛋白酶在室溫以下快速處理用緩沖液維持pH,離子強(qiáng)度目的:穩(wěn)定樣品33三步純化策略Step純度粗提中度純化精細(xì)純化樣品準(zhǔn)備,萃取,凈化

達(dá)到最高純度去除大部分雜質(zhì)

分離,濃縮和穩(wěn)定樣品34三步純化策略步驟粗提精細(xì)純化層析填料的顆粒大小中度純化35三步純化策略步驟粗提精細(xì)純化流速中度純化36三步純化策略步驟粗提精細(xì)純化分辯率中度純化37粗提目的純化粗樣快速濃縮(減少體積)和穩(wěn)定樣品(去除蛋白酶)最適用層析技術(shù):離子交換/疏水層析分辯率快速回收率載量38粗提:離子交換填料 預(yù)裝柱20ml 顆粒大小 流速HiPrep?16/10QXL&SPXL 90μm 10ml/minHiPrep16/10DEAE&CM

90μm 10ml/minSepharose?BigBeadsSTREAMLINE?Sepharose?FastFlow39粗提:疏水層析填料高載量高流速HiPrep?16/10Phenyl(高&低取代)HiPrep16/10ButylHiPrep16/10OctylHiTrap?HIC選擇試劑盒放大40中度純化目的

去除大部分雜質(zhì)最適用層析技術(shù):離子交換/疏水層析HiLoad?離子交換和疏水層析預(yù)裝柱分辯率快速回收率載量41中度純化:離子交換填料Sepharose?HP34μmQ&SP<150cm/hr小包裝和預(yù)裝柱

交聯(lián)瓊脂醣SOURCE?

30μmSepharose

HighPerformanceSOURCE

30

Q&S<1800cm/hr聚苯乙烯/二乙烯基苯小包裝42中度純化:疏水層析填料Sepharose?HP

34μm苯基300cm/hr小包裝和預(yù)裝柱43回收率載量精細(xì)純化目的達(dá)到最終純度(去除聚合物,結(jié)構(gòu)變異物)最適用層析技術(shù):凝焦過濾/離子交換/疏水層析/反相層析分辯率速度44精細(xì)純化:凝膠過濾填料Superdex?

PeptideSuperdex

200Superdex

75Mr3000-70000Mr100-7000

Mr10000-600000分離分子量大小(球狀蛋白質(zhì))102 103 104 105 106用prepgrade(34μm)放大HR預(yù)裝柱(13μm)45精細(xì)純化:凝膠過濾填料Superdex?

30pgSuperdex

200pgSuperdex

75分離分子量大小(球狀蛋白質(zhì))102 103 104 105 106PrepGrade

(34μm)有HiLoad?預(yù)裝柱和小包裝填料Mr100-7000

Mr3000-70000Mr10000-60000046精細(xì)純化:離子交換填料Mono?Beads

Q&S10μm:MonoQ&S>25mg上樣載量3

μm:Mini

Q&SMini?Beads

Q&S<2mg上樣載量47精細(xì)純化:離子交換和疏水層析填料RESOURCE?15μmQ,S,Phenyl,Ether,Isopropyl1ml預(yù)裝柱流速高達(dá)10ml/minRESOURCEHICTestKit48精細(xì)純化:反相層析填料Sephasil?μRPCSOURCE?RPC硅膠3μmC2/C18聚苯乙烯/二乙烯基苯120?:肽類C4,C8,C185and12μm硅膠100?:肽類300?:蛋白質(zhì)pH1-12(14)肽類5,15and30μm49Source?30μm15μm5μm離子交換/疏水層析/反相層析反相層析離子交換/反相層析50適用於三步純化策略的層析技術(shù)蛋白質(zhì)性質(zhì) 層析技術(shù)凈電荷 離子交換(IEX)大小 凝膠過濾(GF)疏水性 疏水層析(HIC),

反相層析(RPC)生物辯識(配基特異性) 親和層析(AC)配基特異性，凈電荷, 擴(kuò)張柱床吸附技術(shù)(EBA)疏水性

有AC,IEXorHIC51適用於三步純化策略的層析技術(shù)層析技術(shù)主要特色粗提中度純化精細(xì)純化IEX高分辨率高載量快速HIC分辨率好載量一般快速AC高分辨率高載量快速GF高分辨率RPC高分辨率52適用於三步純化策略的層析技術(shù)層析技術(shù)樣品起始狀態(tài)樣品結(jié)束狀態(tài)IEX低離子強(qiáng)度高離子強(qiáng)度或pH改變樣品體積不受限制樣品被濃縮HIC高離子強(qiáng)度低離子強(qiáng)度樣品被濃縮AC特異性結(jié)合特異性洗脫條件樣品體積不受限制樣品被濃縮GF樣品體積受限制交換緩沖液(<5%總柱體積)流速受限制樣品被稀釋RPC需要有機(jī)溶劑在有機(jī)溶劑中，或會損失生物活性樣品體積不受限制53純化工藝中不同層析技術(shù)的銜接一般準(zhǔn)則:結(jié)合互補(bǔ)選擇性的技術(shù)，純化工藝應(yīng)盡量采用不同層析技術(shù)(e.g.IEX,HICandGF)減少不同層析技術(shù)間的樣品處理(e.g.濃縮,交換緩沖液)盡量簡單54銜接層析技術(shù)時注意事項層析技術(shù)結(jié)束情況起始條件小量樣品GF低離子強(qiáng)度IEX高離子強(qiáng)度或pH改變高離子強(qiáng)度HIC低離子強(qiáng)度特異性結(jié)合條件AC特異性洗脫條件樣品稀釋交換緩沖液(如果需要)

55合理銜接不同層析技術(shù)低溶解度的蛋白質(zhì)SDS萃取SDS萃取溶解試劑(尿素,乙二醇非離子性清潔劑)GF(在非離子性清潔劑中)

HIC

HIC

GF

GF56合理銜接不同層析技術(shù)粗樣或樣品含高鹽GF脫鹽GF脫鹽GF脫鹽ACIEXHIC或者需要稀釋IEXIEXHICGF或RPCGF或RPCGFGF樣品澄清粗提中度純化精細(xì)純化57合理銜接不同層析技術(shù)樣品非常澄清或很稀

ACIEXIEX沉淀(e.g.在高離子強(qiáng)度下)HIC重新溶解GF作含高鹽樣品處理粗提中度純化精細(xì)純化GF或RPCGF或RPC58一種不穩(wěn)定，氧氣敏感酶的純化，結(jié)晶和三維結(jié)構(gòu)測定Purificationofalabile,oxygen-sensitiveenzymeforcrystallizationand3Dstructuredetermination一個可溶性，非融合蛋白質(zhì)的

多維純化去乙酰氧化頭孢菌素C合成酶DeacetoxycephalosporinCsynthase(DAOCS)RamaBhikhabhaiandHelenaHedlund,AmershamPharmaciaBiotech聯(lián)合合作

MatthewLloydandChristopherSchofield,OxfordCentreforMolecularSciences,Oxford,UKIngerAndersson,SwedishUniversityofAgriculturalSciences,Uppsala,Sweden59DAOCS去乙酰氧化頭孢菌素C合成酶D-AA=d-(D-a-aminoadipoyl)主要參與在頭孢菌素和來自鏈絲菌clavuligerus中青霉素N的頭霉菌素的生物合成屬于非紅血素類亞鐵依賴性的氧化酶青霉素NDAOCSRingexpansion去乙酰氧化頭孢菌素C60DAOCS-純化策略純化目標(biāo)DAOCS·定性準(zhǔn)備樣品精細(xì)純化粗提快速探索填料(scouting)快速探索梯度(scouting)中度純化快速探索填料(scouting)快速探索梯度(scouting)61DAOCS-純化目標(biāo)得到5-10mgDAOCS，純度足夠進(jìn)行結(jié)晶和X-射線繞射分析在一個工作天內(nèi)完成整個純化流程工藝可放大最少10倍.62結(jié)晶純需要大分子均一性

-其他,污染性蛋白質(zhì)序列均一性

-蛋白水解片段

-轉(zhuǎn)譯后修飾

-其他修飾(氧化等)構(gòu)象均一性

-聚合

-失活要拿到高純度結(jié)晶，必須

使用純和均勻的蛋白質(zhì)63DAOCS-定性參數(shù)

等電點

分子量鹽穩(wěn)定性一般穩(wěn)定性

對純化設(shè)計的影響在粗提時使用中性pH進(jìn)行陰離子交換層析用Superdex?75prepgrade凝膠過濾技術(shù)進(jìn)行精細(xì)純化可以使用疏水層析在緩沖液中加DTT工藝設(shè)計重點縮短整體純化時間數(shù)值4.834500>2M(NH4)2SO4容易氧化64DAOCS-一般準(zhǔn)則在所有緩沖液中加DTT使所有半胱氨酸殘基保持還原狀態(tài)加入蛋白酶抑制劑以保持生物活性用SDSPAGE檢查每一個組份中DAOCS利用酶測定法測量生物活性65準(zhǔn)備樣品懸浮細(xì)菌細(xì)胞在溶解緩沖液中超聲震蕩破碎細(xì)胞DNA沉淀利用離心沉淀來源:從

S.

Clavuligerus克隆得到的DAOCS基因和在大腸桿菌的胞漿中擴(kuò)增66選擇粗提的層析技術(shù)陰離子交換:快速,濃縮樣品處理最簡單分離基礎(chǔ):電荷因為DACOS的酸性pI和不穩(wěn)定性，所以緩沖液選擇中性pH67粗提-在?KTA?FPLC

上優(yōu)化梯度線性梯度步級梯度優(yōu)化梯度層析柱: HiPrep?16/10QXL系統(tǒng): ?KTAFPLC0102030min01002003001002003004000020406080mAUmlmS/cm01002001000200030000020406080mAUmlmS/cm01020min01002001000200030000020406080mAUmlmS/cm01020min68選擇中度純化技術(shù)HIC:分離基礎(chǔ):疏水性蛋白質(zhì)疏水性質(zhì)很難預(yù)測:篩選適合填料HIC可以跟IEX互補(bǔ)銜接,減少樣品處理步驟(只需要加鹽)DAOCS在高鹽下能保持穩(wěn)定69選擇精細(xì)純化的層析技術(shù)GF:分離基礎(chǔ):分子量差異GF:最適合分離雙體，寡聚體和聚合物70DAOCS-優(yōu)化好的粗提步驟層析柱: HiPrep?16/10QXL系統(tǒng): ?KTA?FPLC濃縮樣品快速去除有害物質(zhì)01002001000200030000020406080mAUmlmS/cm71DAOCS-優(yōu)化好的中度純化步驟層析柱: SOURCE?15ISO

內(nèi)徑16mm,長度50mm系統(tǒng): ?KTA?FPLCHIC和IEX

互補(bǔ)濃縮樣品除去大部分雜質(zhì)01002001002003004000mlA280nm72DAOCS-優(yōu)化好的精細(xì)純化步驟層析柱: HiLoad?16/60Superdex?75prepgrade系統(tǒng): ?KTA?FPLC去除聚合物和余下的少量污染物交換緩沖液08060402010020040060080010000mlmAU73DAOCS-用SDS分析4321MMM - LMW低分子量標(biāo)記1 - 樣品2 - 組份-QSepharo