色譜基礎(chǔ)知識(shí)及原理第1頁(yè)/共116頁(yè)關(guān)于色譜色譜是一種分離工具，而不是傳統(tǒng)意義上的分析儀器常見(jiàn)的分離方式：蒸餾、離心、電泳、過(guò)濾、超濾等等色譜是其中一種分離工具第2頁(yè)/共116頁(yè)色譜法簡(jiǎn)介色譜法（Chromatography）溯源俄國(guó)科學(xué)加1903年發(fā)現(xiàn)色譜的吸附原理，開(kāi)創(chuàng)了應(yīng)用吸附原理分離植物色素的新方法并見(jiàn)諸于俄文的文獻(xiàn)1906年正式命名（見(jiàn)諸文獻(xiàn)）色譜法；Chromatography30年代開(kāi)始廣泛研究和應(yīng)用主要是氣相色譜及薄層色譜高效液相色譜法的廣泛應(yīng)用始于70年代第3頁(yè)/共116頁(yè)色譜的發(fā)明人俄國(guó)科學(xué)家：M.S.Tswett正式命名“色譜”的文獻(xiàn)第4頁(yè)/共116頁(yè)色譜分離的機(jī)理分離是一個(gè)物理的過(guò)程流動(dòng)相（MobilePhase）固定相（StationaryPhase）樣品（溶解于流動(dòng)相中的溶質(zhì)）第5頁(yè)/共116頁(yè)什么是液相色譜氣相色譜：流動(dòng)相是氣相液相色譜：流動(dòng)相是液相第6頁(yè)/共116頁(yè)什么是高效液相色譜HighPerformanceLiquidChromatography高效液相色譜法，簡(jiǎn)稱：HPLC是一種區(qū)別于經(jīng)典液相色譜；基于儀器方法的高效能分離手段：高性能的色譜柱，高精度、耐高壓的輸液泵以及高靈敏度的檢測(cè)器……廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域：醫(yī)藥/環(huán)保/石化/生命科學(xué)/食品及農(nóng)業(yè)……在技術(shù)，理論及應(yīng)用上仍處于發(fā)展階段第7頁(yè)/共116頁(yè)HPLC的儀器配置及流程溶劑

色譜泵自動(dòng)進(jìn)樣器

HPLC色譜柱檢測(cè)器廢液數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)第8頁(yè)/共116頁(yè)HPLC的儀器配置及流程色譜泵自動(dòng)進(jìn)樣器色譜柱及柱溫箱檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)溶劑第9頁(yè)/共116頁(yè)色譜圖：HPLC圖形結(jié)果（Chromatogram）色譜圖即色譜柱流出物通過(guò)檢測(cè)器時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)對(duì)時(shí)間的曲線圖，其縱坐標(biāo)為信號(hào)強(qiáng)度，橫坐標(biāo)為保留時(shí)間?！V峰保留時(shí)間（分）基線↓峰高峰寬響應(yīng)值第10頁(yè)/共116頁(yè)液相色譜圖相關(guān)術(shù)語(yǔ)色譜峰－Peak色譜柱流出組分通過(guò)檢測(cè)器時(shí)產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)的微分曲線峰底－PeakBase峰的起點(diǎn)與終點(diǎn)之間連接的直線峰高－PeakHeight峰最大值到峰底的距離峰寬－PeakWidth在峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所作切線與峰底相交兩點(diǎn)之間的距離半（高）峰寬－PeakWidthatHalfHeight通過(guò)峰高的中點(diǎn)作平行于峰底的直線，其與峰兩側(cè)相交兩點(diǎn)之間的距離第11頁(yè)/共116頁(yè)液相色譜圖相關(guān)術(shù)語(yǔ)峰面積－PeakArea峰與峰底之間的面積,又稱響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差；σ－StandardError0.607倍峰高處所對(duì)應(yīng)峰寬的一半拖尾峰－TailingPeak后沿較前沿平緩的不對(duì)稱峰前伸峰－LeadingPeak前沿較后沿平緩的不對(duì)稱峰鬼峰－GhostPeak并非由試樣所產(chǎn)生的峰；亦稱假峰第12頁(yè)/共116頁(yè)液相色譜圖相關(guān)術(shù)語(yǔ)基線－Baseline在正常操作條件下，僅由流動(dòng)相所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)的曲線基線飄移－BaselineDrift基線隨時(shí)間定向的緩慢變化基線噪聲；N－BaselineNoise由各種因素所引起的基線波動(dòng)譜帶擴(kuò)展－BandBroadening由于縱向擴(kuò)散,傳質(zhì)阻力等因素的影響,使組分在色譜柱內(nèi)移動(dòng)過(guò)程中譜帶寬度增加的現(xiàn)象第13頁(yè)/共116頁(yè)液相色譜圖相關(guān)術(shù)語(yǔ)死時(shí)間，t0

－Deadtime不被固定相滯留的組分，從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的時(shí)間保留時(shí)間，tR

－Retentiontime組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的時(shí)間死體積，V0

－Deadvolume不被固定相滯留的組分，從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的流動(dòng)相體積保留體積，VR

－Retentionvolume組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的流動(dòng)相體積第14頁(yè)/共116頁(yè)液相色譜應(yīng)用：制備型液相色譜分離及純化樣品是液相色譜原理的直接利用對(duì)分離及純化的要求化合物的穩(wěn)定性樣品的復(fù)雜性制備量的要求純度的要求，及純度的鑒定方法的安全性第15頁(yè)/共116頁(yè)色譜方法轉(zhuǎn)換如果沒(méi)有與文獻(xiàn)或要求相近的色譜柱轉(zhuǎn)換進(jìn)樣量轉(zhuǎn)換流速第16頁(yè)/共116頁(yè)液相色譜應(yīng)用：分析型液相色譜定量分析主要基于與標(biāo)準(zhǔn)品的比較是其最大應(yīng)用領(lǐng)域定性分析；不是色譜的強(qiáng)項(xiàng)基于樣品的保留時(shí)間比較借助于和其聯(lián)用的紫外、質(zhì)譜或其他檢測(cè)器對(duì)定量及定性分析的要求靈敏度、精度及準(zhǔn)確度的要求樣品量的要求；復(fù)雜樣品的分析能力容易使用第17頁(yè)/共116頁(yè)液相色譜原理－基本概念及方法開(kāi)發(fā)液相色譜實(shí)驗(yàn)所需的基本參數(shù)流動(dòng)相：種類及配比，等度或梯度固定相：色譜柱類型及內(nèi)徑、長(zhǎng)短流動(dòng)相輸送系統(tǒng)參數(shù)：流速檢測(cè)器參數(shù)：紫外檢測(cè)波長(zhǎng)，靈敏度等溫度控制進(jìn)樣量以上參數(shù)即構(gòu)成一個(gè)具體的HPLC方法；亦稱色譜條件第18頁(yè)/共116頁(yè)評(píng)價(jià)液相色譜方法的標(biāo)準(zhǔn)問(wèn)題：什么樣的分離結(jié)果是好的？分離度？第19頁(yè)/共116頁(yè)什么是色譜的分離度分離度的公式：R：分離程度的量度第20頁(yè)/共116頁(yè)影響分離度的因素：K’、α及N分離度方程：

K‘是容量因子，表達(dá)了被分離組分與柱填料之間作用的強(qiáng)弱

α是分離因子，描述兩個(gè)被分離組份分離的好壞程度，是化學(xué)因素

N是理論塔板數(shù)，描述色譜峰譜帶展寬的程度第21頁(yè)/共116頁(yè)若

N增加2倍或3倍,R會(huì)如何變化?分離度方程解析：柱效項(xiàng)第22頁(yè)/共116頁(yè)N＝理論塔板數(shù)：分離效率的量度PW=.5PW=2第23頁(yè)/共116頁(yè)色譜柱的柱效N理論塔板數(shù)計(jì)算公式：W s

方法Wtan 16 切線法Wh 5.54 半峰高W3s 9 3sW4s 16 4sW5s 25 5s第24頁(yè)/共116頁(yè)峰寬與塔板數(shù)的關(guān)系理論塔板數(shù)峰寬（L）k

＝2，Vo

＝1000L第25頁(yè)/共116頁(yè)塔板數(shù)與流速的關(guān)系流速（cm/min）

塔板數(shù)×103

第26頁(yè)/共116頁(yè)分離度與N的關(guān)系第27頁(yè)/共116頁(yè)分離度方程解析：分離因子項(xiàng)

若=1.1or1.4，R會(huì)如何變化？第28頁(yè)/共116頁(yè)

＝分離因子：峰分離程度的量度V1V2V3V0時(shí)間

0.5125第29頁(yè)/共116頁(yè)分離因子：α定義：

a=1時(shí)兩組分分不開(kāi)，改變a的途徑改變固定相或改變流動(dòng)相改變溫度改變樣品的本身性質(zhì)第30頁(yè)/共116頁(yè)通過(guò)改變流動(dòng)相改變?chǔ)?，同樣?qiáng)度的不同溶劑改變色譜柱改變分離因子α

的例子第31頁(yè)/共116頁(yè)若=1,2,10or20,R會(huì)如何變化?分離度方程解析：容量因子項(xiàng)第32頁(yè)/共116頁(yè)K

＝容量因子：保留能力的量度V0V1V2V3時(shí)間

0.5125第33頁(yè)/共116頁(yè)

k值

k項(xiàng)

k對(duì)分離度影響

00011/2.5022/3.6733/4.751010/11.912020/21.95容量因子k與分離度的關(guān)系與R的關(guān)系第34頁(yè)/共116頁(yè)容量因子k

與峰高的關(guān)系改變k’

值的方法：調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性、pH、離子強(qiáng)度等梯度淋洗第35頁(yè)/共116頁(yè)改變?nèi)萘恳蜃?/p>

K’的例子譜圖第36頁(yè)/共116頁(yè)α、k’

及

N如何控制分離度第37頁(yè)/共116頁(yè)液相色譜原理－更進(jìn)一步的探討離子型化合物的分離方式多數(shù)化合物是離子型的！使用離子交換柱：離子交換法主要用于“強(qiáng)”陰、陽(yáng)離子使用反相柱離子抑制色譜法：通過(guò)改變流動(dòng)相的pH值，使樣品成中性離子對(duì)色譜法：加入“對(duì)離子”，使樣品呈中性第38頁(yè)/共116頁(yè)離子抑制色譜離子型化合物在反相色譜柱上不保留改變流動(dòng)相的pH值，抑制樣品離子的電離主要適用于弱酸性化合物的分離降低流動(dòng)相的pH值，使樣品降低離子化使用硅膠基質(zhì)C18填料使用條件應(yīng)在填料基質(zhì)的范圍內(nèi)硅膠柱的pH在2-8（較保險(xiǎn)值3-7）內(nèi)第39頁(yè)/共116頁(yè)離子抑制色譜實(shí)例而在乙腈/水并且pH=7時(shí)，多數(shù)組份保留時(shí)間很短，無(wú)法完全分離。第40頁(yè)/共116頁(yè)離子抑制色譜的使用范圍下列情況下不能使用離子抑制方法，如果：一些酸在pH低于2時(shí)還保持離子化一些堿在pH高于7時(shí)還保持離子化可以有以下的選擇離子交換色譜使用聚合物或其他耐堿性流動(dòng)相的反相柱，在pH高于7時(shí)用離子抑制法使用“離子對(duì)色譜法” 第41頁(yè)/共116頁(yè)在高pH值下用離子抑制色譜柱：D18-613(聚合物基質(zhì))，室溫流動(dòng)相：乙腈/0.01MNH4OH +0.01MTBA流速：1.0ml/min檢測(cè)：UV-240nm樣品：巴比妥的衍生物①巴比妥②己瑣巴比妥③甲基苯巴比妥④速可巴比妥第42頁(yè)/共116頁(yè)離子對(duì)色譜法在反相色譜流動(dòng)相內(nèi)加入“離子對(duì)”試劑與樣品中可電離的組份形成“對(duì)離子”在反相色譜柱上分離離子型化合物離子對(duì)試劑的類型：磷酸季丁銨（PICA），適用于弱酸烷基磺酸鹽（PICB），適用于弱堿烷基長(zhǎng)度不同，形成對(duì)離子的能力不同通常有：B5，B6，B7，B8–后面的數(shù)字是碳鏈的長(zhǎng)度磷酸二丁胺（PICD4），適用于弱堿第43頁(yè)/共116頁(yè)離子對(duì)色譜機(jī)理第44頁(yè)/共116頁(yè)使用五烷基磺酸鹽Packing: BondapakC18Column: 4mmIDx30cmSolvent: Methanol/H2Owith0.005MPENTANE SulfonicAcid&1%HOAc(50/50)FlowRate:2.0ml/minDetector:UV,254nm,0.1AUFS1.MaleicAcid2.Phenylephrine-HCl3.Phenylpropanolamine-HCl4.Naphazoline-HCl5.Phenacetin6.PyrilamineMaleate第45頁(yè)/共116頁(yè)使用六烷基磺酸鹽Packing: BondapakC18Column: 4mmIDx30cmSolvent: Methanol/Waterwith0.005M HEXANESulfonicAcid& 1%HOAc(50/50)FlowRate:2.0ml/minDetector:UV,254nm,0.1AUFS1.MaleicAcid2.Phenylephrine-HCl3.Phenylpropanolamine-HCl4.Naphazoline-HCl5.Phenacetin6.PyrilamineMaleate第46頁(yè)/共116頁(yè)用離子對(duì)、還是用離子抑制方法？第47頁(yè)/共116頁(yè)開(kāi)發(fā)液相色譜方法的考慮因素分離度是色譜分離中主要考慮的因素除分離度之外，在開(kāi)發(fā)色譜方法時(shí)，以下幾個(gè)因素也都要考慮：靈敏度載樣量分析速度溶劑損耗成本容易使用色譜柱壽命效率第48頁(yè)/共116頁(yè)基本的HPLC系統(tǒng)溶劑

色譜泵自動(dòng)進(jìn)樣器HPLC色譜柱檢測(cè)器廢液數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)第49頁(yè)/共116頁(yè)色譜泵及液相色譜對(duì)泵的要求穩(wěn)定平滑并且重現(xiàn)性好的流速可靠且充分的溶劑混合準(zhǔn)確及重現(xiàn)的自動(dòng)溶劑混合準(zhǔn)確及重現(xiàn)的梯度形成有效的流速范圍制備色譜或微柱、窄柱色譜更為關(guān)注滯后體積僅僅應(yīng)用于梯度實(shí)驗(yàn)?zāi)康模涸谌魏吻闆r下保持最高精度第50頁(yè)/共116頁(yè)梯度：高壓混合高壓梯度使用多臺(tái)色譜泵，在泵后混合配置靈活、簡(jiǎn)單，脫氣簡(jiǎn)單易調(diào)節(jié)梯度的滯后體積第51頁(yè)/共116頁(yè)梯度：低壓混合低壓梯度用單泵產(chǎn)生梯度，泵前（低壓端）混合對(duì)脫氣要求高不易調(diào)節(jié)梯度的滯后體積如設(shè)計(jì)不當(dāng)，梯度的

準(zhǔn)確性受影響滯后體積（系統(tǒng)

體積）設(shè)計(jì)合理第52頁(yè)/共116頁(yè)梯度滯后：系統(tǒng)體積的影響死體積/譜帶展寬體積(無(wú)色譜柱時(shí))滯后(系統(tǒng))體積滯后(系統(tǒng))體積溶劑輸送系統(tǒng)(泵)檢測(cè)器進(jìn)樣器色譜柱梯度混合器溶劑輸送系統(tǒng)(泵)高壓梯度注意∶滯后體積包括進(jìn)樣器、阻尼器、混合器及其管路比例閥檢測(cè)器進(jìn)樣器ABCD色譜柱溶劑輸送系統(tǒng)(泵)低壓梯度阻尼器混合器第53頁(yè)/共116頁(yè)梯度滯后大小的影響滯后體積太大會(huì)引起梯度變化的延遲例如：滯后體積為2.0ml，流速1.0ml/min實(shí)際梯度會(huì)比設(shè)置值晚2分鐘響應(yīng)，沒(méi)有問(wèn)題對(duì)微柱色譜影響更大，同上例但流速0.1ml/min實(shí)際梯度會(huì)比設(shè)置值晚20分鐘響應(yīng)，不能接受滯后體積的不同會(huì)使方法轉(zhuǎn)換麻煩滯后體積比文獻(xiàn)大或小都會(huì)使方法不能重現(xiàn)滯后體積的變化會(huì)導(dǎo)致梯度重現(xiàn)性不好普通分析型液相色譜的滯后體積為2~4ml第54頁(yè)/共116頁(yè)滯后體積變化的影響設(shè)計(jì)不好的HPLC系統(tǒng)，滯后體積隨反壓變化滯后體積隨反壓變化的后果：梯度的準(zhǔn)確性不好，造成：方法的適應(yīng)性不好用靜態(tài)梯度混合器；固定滯后體積可明顯改善梯度特性梯度百分比保留時(shí)間梯度曲線好的梯度滯后曲線保留時(shí)間梯度百分比不好的梯度滯后曲線固定滯后體積，改善了梯度性能普通的低壓梯度系統(tǒng)第55頁(yè)/共116頁(yè)色譜柱反壓變化對(duì)梯度實(shí)驗(yàn)的影響P680ALPGwithoutpulsedamperBack-pressure:

60bar,85barand

105barVariation:<1%5681012-100200400600900mAUMinutesMethylparabeneEthylparabenePropylparabeneButylparabene5681012-100200400600900mAUMinutesMethylparabeneEthylparabenePropylparabeneButylparabenePumpwithpulsedamperBack-pressure:

60bar,85barand

105barVariation:>2%Acclaim120,C18,5μm,4.6x100mm;0.5mL/min;25°C;5μLinjectionvolume;UVdetectionat256nm;Eluent(A)Waterand(B)Acetonitril;Gradient:30%bto100%Bin10min;Methyl-,Ethyl-,Propyl-andButylparabene,10mg/Leach第56頁(yè)/共116頁(yè)液相色譜的檢測(cè)器常規(guī)檢測(cè)器示差折光檢測(cè)器（RefractiveIndex）紫外/可見(jiàn)光吸收檢測(cè)器（UV-Vis）熒光檢測(cè)器（Fluorescence）蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（EvaporativeLightScattering）其他檢測(cè)器（OtherDetectors）高端檢測(cè)器光電二極管矩陣檢測(cè)器（PhotodiodeArray）質(zhì)譜檢測(cè)器（MassSpectrometry）第57頁(yè)/共116頁(yè)HPLC檢測(cè)器應(yīng)提供的功能對(duì)樣品有響應(yīng)并有一個(gè)輸出信號(hào)應(yīng)該提供在檢測(cè)器響應(yīng)值與樣品濃度之間的線性關(guān)系；并且所設(shè)計(jì)的校正技術(shù)應(yīng)該促進(jìn)這種關(guān)系但是：由于受HPLC系統(tǒng)其他部件的影響會(huì)產(chǎn)生響應(yīng)與濃度之間關(guān)系的與線性偏離現(xiàn)象并不是所有的檢測(cè)器是線性的受HPLC系統(tǒng)其他部件的影響，檢測(cè)器的表現(xiàn)可能與其最佳水平有較大的差距第58頁(yè)/共116頁(yè)用于HPLC的檢測(cè)器沒(méi)有任何一種單獨(dú)的檢測(cè)器可以適應(yīng)所有的液相色譜分離！HPLC檢測(cè)器可以分為：溶質(zhì)性質(zhì)檢測(cè)器（Solutepropertydetectors）對(duì)溶質(zhì)的物理或化學(xué)性質(zhì)響應(yīng)，一般不反應(yīng)流動(dòng)相的變化（選擇型）整體性質(zhì)檢測(cè)器（Bulkpropertydetectors）不管是否有溶質(zhì)，對(duì)流動(dòng)相任何物理性質(zhì)的變化作出響應(yīng)（通用型）第59頁(yè)/共116頁(yè)不同種類的檢測(cè)器的分類整體性質(zhì)示差折光檢測(cè)器蒸發(fā)光散射檢測(cè)器電導(dǎo)檢測(cè)器溶質(zhì)性質(zhì)熒光檢測(cè)器固定波長(zhǎng)可變波長(zhǎng)光電二極管矩陣電化學(xué)檢測(cè)器放射化學(xué)檢測(cè)器氮/硫檢測(cè)器質(zhì)譜檢測(cè)器紫外/可見(jiàn)光檢測(cè)器第60頁(yè)/共116頁(yè)理想的HPLC檢測(cè)器高靈敏度；可忽略的基線噪音寬的線性范圍獨(dú)立于流動(dòng)相及操作參數(shù)的響應(yīng)對(duì)壓力、溫度及流速等變化不敏感長(zhǎng)時(shí)間操作的穩(wěn)定性低死體積非破壞性選擇性第61頁(yè)/共116頁(yè)靈敏度：信噪比靈敏度是信號(hào)與噪音的比值；即峰高與基線噪音的比值（S/N）檢測(cè)限（LOD）：S/N=3定量限（LOQ）：S/N=10好的信噪比有利于：更好的色譜峰確認(rèn)更好的定量更好地完成色譜峰純度/均一性 6:1NS第62頁(yè)/共116頁(yè)方法開(kāi)發(fā)的過(guò)程Adaptedfrom:Snyder,L.R.;Kirkland,J.J.;Glajch,J.L;PracticalHPLCMethodDevelopment2ndEd.,Wiley-Interscience,NewYork,1997,p.21.得到樣品信息，確定分離目標(biāo)2.確定特定HPLC過(guò)程、樣品預(yù)處理等的需求3.選擇檢測(cè)器及其條件4.選擇HPLC方法；初步分離；建立最佳分離條件5.優(yōu)化分離條件6.檢查特定過(guò)程的問(wèn)題及需要7.定量校正8.日常使用的確認(rèn)第63頁(yè)/共116頁(yè)選擇液相色譜的檢測(cè)器要考慮的因素：你要分離的化合物/樣品的化學(xué)特性化學(xué)結(jié)構(gòu)、分子量及紫外光譜等等流動(dòng)相的影響（溶劑、緩沖鹽改性劑等）梯度還是等度靈敏度需求是否有雙檢測(cè)的需求第64頁(yè)/共116頁(yè)選擇液相色譜的檢測(cè)器通用檢測(cè)器 RIELSD MS靈敏度 mg ng pg 線性范圍 104

否 103流速敏感 是 否 是溫度敏感 是 否 否破壞性 否 是 是選擇性檢測(cè)器 ABS FL ECCond MS靈敏度 ng pg fg pg pg線性范圍 105 103 106 105 103流速敏感 否 否 是 是 是溫度敏感 否 否 是 是 是破壞性 否 否 是 否 是第65頁(yè)/共116頁(yè)可供選擇的液相色譜檢測(cè)器Absorbance(UV/Vis)ChemiluminescenceCircularDichroism(Chiral)ConductivityElectrochemicalEvaporativeLightScatteringFluorescenceLaserInducedFlorescenceLaserInterferometerLaserPolarimeterMassSpectrometric(LC/MS)NitrogenSpecificDetectorNuclearMagneticResonanceOfflineMethodsOpticalRotationDetectorPhotoDiodeArrayRefractiveIndexRadiochemicalSulfurSpecificDetectorViscometryMultiAngleLightScattering第66頁(yè)/共116頁(yè)示差折光（RefractiveIndex）檢測(cè)示差折光檢測(cè)器（RI）是第一個(gè)商品化的液相色譜檢測(cè)器（上世紀(jì)六十年代末、七十年代初）通常被認(rèn)為是一種通用檢測(cè)器檢測(cè)溶液中所有被溶解的溶質(zhì)－非特異性任何光學(xué)介質(zhì)的折光率都被定義為光在該介質(zhì)中與真空中的速度之比值RS第67頁(yè)/共116頁(yè)示差檢測(cè)器－基本原理檢測(cè)基于被分析物的折光指數(shù)的差異測(cè)量樣品流路與參比流路在折光指數(shù)上的差別當(dāng)折光指數(shù)差異最大時(shí)靈敏度也達(dá)到最大并不測(cè)量絕對(duì)的折光指數(shù)而是測(cè)定折光指數(shù)的差別（DifferentialRI）典型的應(yīng)用領(lǐng)域沒(méi)有紫外吸收、熒光的化合物，例如：碳水化合物（Carbohydrates）、聚合物（Polymers）脂肪酸（FattyAcids）及油脂類（Lipids）第68頁(yè)/共116頁(yè)示差檢測(cè)器的優(yōu)、缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)通用檢測(cè)器容易使用；通常來(lái)說(shuō)是比較耐用的檢測(cè)器維護(hù)成本低缺點(diǎn)靈敏度低、選擇性差對(duì)流速、溫度及粘度的變化敏感不能用于梯度方法色譜峰可能是正的，也可能是負(fù)的第69頁(yè)/共116頁(yè)示差檢測(cè)器的優(yōu)點(diǎn)－通用性根據(jù)隨機(jī)統(tǒng)計(jì)；任何一對(duì)液體都會(huì)有大約0.07的折光率差異因此；除非正好被分析的樣品與溶液的折光指數(shù)完全相同，都會(huì)被檢測(cè)到SeparationofLactose-ReduceMilkMV-20-100102030405060708090100110Minutes4.04.55.05.56.06.57.07.58.08.59.09.510.010.511.011.512.012.5葡萄糖乳糖半乳糖第70頁(yè)/共116頁(yè)示差檢測(cè)器的缺點(diǎn)－靈敏度缺乏靈敏度－和其他檢測(cè)器相比，RI檢測(cè)器一般靈敏度較低UV@254nmS/N>15000:1MV-30.00-25.00-20.00-15.00-10.00-5.000.005.0010.0015.00Minutes2.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.58.08.59.09.5AU0.000.020.040.060.080.100.120.14RefractiveIndexS/N~125:1流動(dòng)相： MeOH/H2O60:40流速： 1.0mL/min色譜柱： C18色譜柱溫：30oC檢測(cè)溫度：35oC樣品： ParabenMixture第71頁(yè)/共116頁(yè)示差檢測(cè)器的缺點(diǎn)－不適宜作梯度流動(dòng)相： A=CH3CN/H2O75:25 B=CH3CN流速： 1.4mL/min色譜柱： NH2色譜柱溫： 30oC檢測(cè)溫度： 35oCMV-2600-2400-2200-2000-1800-1600-1400-1200-1000-800-600-400-2000200400Minutes0246810121416182022242628300%B25%BChromatographyForum:IsRIwithaReversePhasegradientpossible?

ByXXXXXXXXX:Ihaveagoodseparationofamulti-substituted,cyclohexanethatfullyresolves~12differentoligomers.IcandetectthecomponentsbyMS,butIwouldliketouseastandardLCdetectorinstead.Thereisvirtuallynoadsorptionabove230nmandbelow230nmpicksupsolventinterference.I’mconsideringusingRIdetectionandafterwardsubtractingablankrun.IsthereanyhopeofthisworkingorwouldIbewastingmytime?/第72頁(yè)/共116頁(yè)示差檢測(cè)器的缺點(diǎn)－對(duì)溫度敏感流動(dòng)相－甲醇@0.25mL/minute檢測(cè)器溫度－35?C；沒(méi)有使用柱溫箱Temp.(DegC)18.519.019.520.0MV-1.000.001.002.00Minutes51015202530354045505560657075室溫變化RI基線第73頁(yè)/共116頁(yè)吸光度（AbsorbanceUV/Vis）檢測(cè)目前實(shí)驗(yàn)室中最流行的選擇多數(shù)公司約75%的檢測(cè)器是吸光度檢測(cè)器（其中50%是多波長(zhǎng)，25%是PDA）測(cè)量通過(guò)溶液后的紫外或可見(jiàn)光光強(qiáng)度的損失吸光度與樣品濃度呈線性關(guān)系在被測(cè)物的最大吸收波長(zhǎng)處檢測(cè)時(shí)靈敏度最大第74頁(yè)/共116頁(yè)吸光度檢測(cè)器（UV/Vis）－優(yōu)點(diǎn)這種檢測(cè)器簡(jiǎn)單、可靠多數(shù)人熟悉并喜歡這種技術(shù)可以作梯度實(shí)驗(yàn)并且是非破壞性的大多數(shù)有機(jī)化合物有一定程度的吸光度一般來(lái)說(shuō)靈敏度還可以AU0.000.050.100.15Minutes0.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.00Parabensat254nm第75頁(yè)/共116頁(yè)吸光度檢測(cè)器（UV/Vis）－缺點(diǎn)由于不是所有化合物都有吸光度，因此不是通用檢測(cè)器對(duì)某些化合物的檢測(cè)靈敏度不及其他檢測(cè)器樣品中不同化合物的最大吸收波長(zhǎng)不同時(shí)，需要使用多波長(zhǎng)檢測(cè)，或使用折衷的波長(zhǎng)受流動(dòng)相組成的影響：用截止波長(zhǎng)以上至少5～10nm作為工作波長(zhǎng)緩沖鹽、離子對(duì)試劑、胺改性劑也會(huì)有影響第76頁(yè)/共116頁(yè)背景吸收的影響背景吸收降低了線性范圍多數(shù)流動(dòng)相有紫外吸收實(shí)際濃度理想10吸光度210背景吸收第77頁(yè)/共116頁(yè)背景吸收對(duì)紫外檢測(cè)器噪音的影響UVSpectrumofEluentswith0.1%TFAAgainstHPLCGradeH2OBlankAU0.000.100.200.300.400.500.600.700.800.901.001.101.201.301.401.50nm200.00210.00220.00230.00240.00250.00260.00270.00280.00290.00H20with0.1%TFA50%ACNwith0.1%TFA第78頁(yè)/共116頁(yè)溶劑混合的基線噪音色譜條件色譜柱：

C18,

5μm,3.9x150mmat35oC.流動(dòng)相：

A:0.1%TFAinWater. B:0.1%TFAinAcetonitrile.梯度：5-40%Bin35min.流速：1.0mL/min.樣品：水（10μLinj.vol.）檢測(cè)：214nm

圖1；好的梯度系統(tǒng)

圖2；一般的二元梯度系統(tǒng)

圖3；一般的四元梯度系統(tǒng)第79頁(yè)/共116頁(yè)為何如此重要？五個(gè)小肽的5ng進(jìn)樣，好的色譜系統(tǒng)非常容易鑒別出所有峰。在不好的色譜系統(tǒng)中，第一個(gè)峰則消失在基線噪音中。第80頁(yè)/共116頁(yè)基線噪音對(duì)積分的影響1.2241.1831.183Caffeine@271nm第81頁(yè)/共116頁(yè)熒光（Fluorescence）檢測(cè)發(fā)熒光的化合物吸收光（UV或VIS），其分子達(dá)到激發(fā)態(tài)，其返回到基態(tài)時(shí)發(fā)射光的現(xiàn)象即熒光基態(tài)激發(fā)態(tài)S1S0激發(fā)（1）振動(dòng)能（2）發(fā)射（3）1.分子在吸收UV或可見(jiàn)光后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，分子達(dá)到不穩(wěn)定的高能量狀態(tài)。2.電子失去過(guò)剩的能量成為振動(dòng)能，并達(dá)到最低的激發(fā)單重態(tài)。3.電子失去能量達(dá)到基態(tài)時(shí)發(fā)出熒光共軛及芳香族化合物最容易有熒光現(xiàn)象第82頁(yè)/共116頁(yè)熒光檢測(cè)器原理第83頁(yè)/共116頁(yè)熒光檢測(cè)器的應(yīng)用環(huán)境中的污染物多環(huán)芳烴(PAH)，多酚，氨基甲酸酯等食品、飲料食品中的毒素；例如：黃曲霉毒素染料維生素及衍生氨基酸生物技術(shù)及制藥氨基甲酸酯類殺蟲(chóng)劑黃曲霉毒素多環(huán)芳烴（PAH）維生素第84頁(yè)/共116頁(yè)熒光檢測(cè)器的優(yōu)點(diǎn)選擇性提高靈敏度提高（在pg/fg范圍）低背景技術(shù)mV-0.100.000.100.200.300.400.50Minutes5.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.006.8949.639MDA及MDMA柱上200pgExcitation=280Emission=360第85頁(yè)/共116頁(yè)熒光檢測(cè)器的缺點(diǎn)不是所有化合物都有熒光，需要衍生檢測(cè)器對(duì)溶解氣體及其他淬滅物質(zhì)（如甲醇）敏感對(duì)Ex及Em的最佳，易受溫度、溶劑的極性和粘度、溶劑的pH值及樣品濃度影響多數(shù)儀器的批次間差異較大，同一型號(hào)的不同熒光檢測(cè)器會(huì)得到不同的結(jié)果。有的儀器信號(hào)及噪音大于另一臺(tái)2～3倍，光電倍增管的特征是導(dǎo)致這個(gè)現(xiàn)象的原因。第86頁(yè)/共116頁(yè)溶劑中溶解的氣體對(duì)響應(yīng)值的影響MinutesColumn-PAHColumn@27oCEluentA:WaterEluentB:AcetonitrileGradient:60%Bto100%Busingcurve9in12minutesHold11minutesBacktoinitialconditionsFlowRate1.2ml/minInjection:20ulTimeprogrammedwavelengthchanges20.521.022.01000MV充分脫氣未充分脫氣FluorescenceDetector1231.Benzo(b)flouranthene-400ppb2.Benzo(k)fluoranthene-200ppb3.Benzo(a)pyrene-200ppb第87頁(yè)/共116頁(yè)濃度對(duì)芘（Pyrene）最大激發(fā)波長(zhǎng)的影響EmissionExcitation~10–3M~10–5M在正己烷中From:Turro,N.J.,ModernMolecularPhotochemistryMenloParkCA,Benjamin/CummingsPublishing,1978第88頁(yè)/共116頁(yè)蒸發(fā)光散射（EvaporativeLightScattering）用氮?dú)獍蚜鲃?dòng)相吹成細(xì)霧狀流動(dòng)相的液滴通過(guò)一個(gè)預(yù)加熱的腔體后被蒸發(fā)掉蒸發(fā)的溶劑被從檢測(cè)器中除去溶質(zhì)的揮發(fā)性小于流動(dòng)相，因此產(chǎn)生顆粒束與光束相交被顆粒散射的光由光電倍增管（PMT）收集PMT的輸出與溶質(zhì)的存在量呈比

例關(guān)系第89頁(yè)/共116頁(yè)蒸發(fā)光散射檢測(cè)器原理EvaporativeLightScattering簡(jiǎn)稱：ELSD第90頁(yè)/共116頁(yè)ELSD－優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用領(lǐng)域通用型－比流動(dòng)相揮發(fā)性小的物質(zhì)都能被檢測(cè)可以作梯度實(shí)驗(yàn)；檢測(cè)下限可到納克級(jí)水平對(duì)環(huán)境條件不敏感；可以使用有強(qiáng)紫外吸收的溶劑作流動(dòng)相應(yīng)用領(lǐng)域：碳水化合物油脂及脂肪酸未衍生的氨基酸制藥行業(yè)表面活性劑天然產(chǎn)物第91頁(yè)/共116頁(yè)ELSD－缺點(diǎn)不能使用不揮發(fā)性的流動(dòng)相（例如：磷酸鹽）要求使用霧化氣源（典型的是氮?dú)猓┎煌纳V條件下霧化及除溶劑的參數(shù)需要重新優(yōu)化破壞性技術(shù)蒸發(fā)出的溶劑要因到戶外或通風(fēng)櫥里對(duì)揮發(fā)性化合物的檢測(cè)不理想一般得到的是非線性校正曲線某些化合物的檢測(cè)靈敏度不如其他檢測(cè)器第92頁(yè)/共116頁(yè)光電二極管矩陣（PhotoDiodeArray）PhotoDiodeArray簡(jiǎn)稱：PDA或DAD第93頁(yè)/共116頁(yè)P(yáng)DA檢測(cè)器－特點(diǎn)三維水平的吸光度檢測(cè)器二極管矩陣檢測(cè)器是在1982年首度出現(xiàn)的在整個(gè)UV-Vis帶寬上檢測(cè)吸光度都需要相應(yīng)的軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析第94頁(yè)/共116頁(yè)P(yáng)DA檢測(cè)器的用途及要求光電二極管檢測(cè)器可以提供許多又用的功能光譜信息色譜峰純度譜庫(kù)擬合像其他所有的UV/Vis檢測(cè)器一樣，需要：高的信噪比；好的線性另外；還需要：光學(xué)分辨率光譜靈敏度及光譜分析軟件第95頁(yè)/共116頁(yè)光學(xué)分辨率（帶寬）好的光譜分辨率可得到高質(zhì)量的光譜信息230.00250.00270.00nmBenzene3.0nmvs

1.0nm

損失分辨率，UV最大波長(zhǎng)移動(dòng)

1.0nm3.0nm190nm5.0nm第96頁(yè)/共116頁(yè)分辨率與色譜性能高分辨率給出更多數(shù)據(jù)點(diǎn)（同樣波長(zhǎng)范圍）高分辨率有更好的線性低分辨率的數(shù)據(jù)文件尺寸較小寬的光學(xué)帶寬可以得到更高的光通量（靈敏度）1.2nm14.4nm第97頁(yè)/共116頁(yè)P(yáng)DA的優(yōu)點(diǎn)及缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)通用的UV/Vis檢測(cè)好的選擇性、線性提供色譜峰的UV/Vis光譜圖（峰確認(rèn)）可提供純度估計(jì)缺點(diǎn)低光學(xué)通量（較窄的帶寬通量）與普通UV/Vis相比更復(fù)雜，容易漂移燈輸出能量隨時(shí)間降低第98頁(yè)/共116頁(yè)質(zhì)譜（MassSpec.）作為HPLC檢測(cè)器m/z+/-MS： 質(zhì)譜（MassSpectrometry）是一種按照分子量及其電荷分離物質(zhì)的技術(shù)，經(jīng)過(guò)多年的不斷開(kāi)發(fā)及改進(jìn)，已經(jīng)使質(zhì)譜成為一種多功能、高靈敏度，并被愈來(lái)愈廣泛使用的分析技術(shù)。LC/MS： 液相色譜與質(zhì)譜的連用。需要： 除去HPLC的溶劑；產(chǎn)生離子；分離離子；檢測(cè)離子；計(jì)算離子強(qiáng)度；處理數(shù)據(jù)第99頁(yè)/共116頁(yè)除去溶劑離子化前的準(zhǔn)備：霧化（Nebulization）蒸發(fā)溶劑或解吸附（Evaporation/orDesorption）大氣壓下或減壓下（AtmosphereorPressurereduction）離子化（Ionization－IonSource）LiquidGasLCMSCo(l)C+/-(l)C+/-(g)Co(g)EvaporationDesorptionLC/MSInterface第100頁(yè)/共116頁(yè)LC-MS的離子產(chǎn)生電子轟擊源（ElectronImpact/ElectronIonizati