蛋白質(zhì)多肽鏈氨基酸序列的測定第1頁/共22頁蛋白質(zhì)一級結構（primarystructure）的測定第2頁/共22頁蛋白質(zhì)測序的發(fā)展簡史

自從1953年Sanger首次完成胰島素的氨基酸順序測定以來，目前已有很大改進。但是Sanger花費多年時間才基本搞清胰島素的一級結構，現(xiàn)在由于方法改進及自動化分析儀器的產(chǎn)生，現(xiàn)在已有數(shù)百種蛋白質(zhì)的氨基酸序列問世。第3頁/共22頁氨基酸序列測定的基本步驟（化學方法）分析已純化蛋白質(zhì)的氨基酸殘基組成測定多肽鏈的氨基末端和羧基末端為何種氨基酸把肽鏈水解成片段測定各肽段的氨基酸排列順序綜合運用多種水解法分析肽段中的氨基酸順序第4頁/共22頁測序前的準備工作要求：樣品純度：97%以上相對分子質(zhì)量：允許誤差在10%左右（一）多肽鏈的拆分幾條多肽鏈借助非共價鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質(zhì)；可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍或高濃度的鹽處理，即可使寡聚蛋白質(zhì)中的亞基。如果多肽鏈間通過共價鍵（S—S）連接在一起，可采用氧化劑或還原劑將其斷裂。（二）測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。（三）二硫鍵的斷裂幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的β-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護生成的巰基，以防它重新被氧化。第5頁/共22頁一、氨基酸組成

蛋白質(zhì)經(jīng)鹽酸水解后成為個別氨基酸，用離子交換樹脂將各種氨基酸分開，測定它們的量，算出各氨基酸在蛋白質(zhì)中的百分組成或個數(shù)。第6頁/共22頁第7頁/共22頁二、末端測定的具體方法化學法

二硝基氟苯法（DNP法）二甲基氨基萘磺酰氯法（Dansyl-氯法）肼解法還原成氨基醇法酶解法亮氨酸氨肽酶法細胞外氨肽酶法

羧肽酶A法羧肽酶B法羧肽酶C法第8頁/共22頁二硝基氟苯法(Sanger法）2,4-二硝基氟苯在堿性條件下，能夠與肽鏈N-端的游離氨基作用，生成黃色二硝基苯衍生物（DNP-氨基酸）第9頁/共22頁氨基肽酶法氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的N-端逐個地向里水解。根據(jù)不同的反應時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，按反應時間和氨基酸殘基釋放量作動力學曲線，從而知道蛋白質(zhì)的N-端殘疾順序第10頁/共22頁C-末端之肼解法多肽與肼在無水條件下加熱，C-端氨基酸即從肽鏈上解離出來，其余的氨基酸則變成肼化物。肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)而與C-端氨基酸分離。肼解過程中，谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等被破壞而不易測出，C-末端的精氨酸轉變?yōu)轼B氨酸第11頁/共22頁羧肽酶法羧肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的C-端逐個地水解。根據(jù)不同的反應時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，從而知道蛋白質(zhì)的C-端殘疾順序羧肽酶來源專一性CpA胰臟能釋放除Pro、Arg、Lys外的所有的C-端氨基酸CpB胰臟主要水解C-端為Arg、Lys的肽鍵CpC植物或微生物相當廣泛，幾乎能釋放C-端的所有氨基酸第12頁/共22頁還原成氨基醇法多肽C-端氨基酸可被硼氫化鋰（LiBH4）還原成α-氨基醇，用層析法可以鑒定氨基酸種類。Sanger早期測定胰島素C-末端氨基酸采用此法。第13頁/共22頁三、水解肽鏈成肽段水解酶或化學試劑水解部位作用的氨基酸胰蛋白酶羧基側賴氨酸、精氨酸胰凝乳蛋白酶羧基側芳香族氨基酸（苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸）溴化氰羧基側甲硫氨酸水解后得到的肽段，可用離子層析或其他層析方法將其分離純化。比如用雙向電泳可以得到肽圖，由此可知肽段的多少。第14頁/共22頁四、Edman降解法測定肽段的氨基酸序列耦聯(lián)：使用苯異硫氰酸酯（PITC）在pH9.0的堿性條件下對蛋白質(zhì)或多肽進行處理，PITC與肽鏈的N-端的氨基酸殘基反應，形成苯氨基硫甲酰（PTC）衍生物，即PTC-肽。水解：

PTC-肽用三氟乙酸處理，N-端氨基酸殘基肽鍵被有選擇地切斷，釋放出該氨基酸殘基的噻唑啉酮苯胺衍生物。

第15頁/共22頁萃取：將該衍生物用有機溶劑（例如氯丁烷）從反應液中萃取出來，而去掉了一個N-端氨基酸殘基的肽仍留在溶液中。轉化：萃取出來的噻唑啉酮苯胺衍生物不穩(wěn)定，經(jīng)酸作用，再進一步環(huán)化，形成一個穩(wěn)定的苯乙內(nèi)酰硫脲（PTH）衍生物，即PTH-氨基酸。

Edman降解法測序每次只能測定幾十個氨基酸殘基，所以要測定較大蛋白質(zhì)的氨基酸序列，需要將其降解為一些肽段，經(jīng)HPLC分離出各個肽段，然后再進行Edman降解測序。第16頁/共22頁五、鑒定每個肽段氨基酸順序ABCDE*ABCDE

部分水解*A,*AB,*ABC,*ABCD,*ABCDE

完全水解*A,*A+B,……*A+B+C+D+E

DNFB*A,*A+*B,……*A+*B*+*C+*D+*E

肽段經(jīng)過分離純化后，即可進行氨基酸測序。但是獲得數(shù)據(jù)之后，還不能得出整條多肽鏈的氨基酸排列順序，因為尚不清楚這些片段在多肽鏈中的先后次序。一般需要用到多種水解法，并分析出各肽段的氨基酸順序，然后經(jīng)過組合排列對比，最終得出完整肽鏈中的氨基酸序列。第17頁/共22頁六、確定肽段在多肽鏈中的次序

利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序?！?/p>

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多肽氨基酸序列重疊法：小片段重疊的原理主要用于一級結構的測定第18頁/共22頁七、確定原多肽鏈中二硫鍵的位置

一般采用胃蛋白酶水解原來的含二硫鍵的蛋白質(zhì)選用該法的好處：該酶的專一性比較低，切點多，生成肽段包括含有二硫鍵的肽段比較小，對后面的分離、鑒定比較容易；該酶的作用pH在酸性范圍，有利于防止二硫鍵發(fā)生交換而造成的麻煩。第19頁/共22頁反向遺傳法分析多肽鏈的氨基酸序列基本原理：中心法則基本步驟：1、分離編碼蛋白質(zhì)的基因2、測定DNA序列3、排列mRNA出序列4、按照三聯(lián)密碼原則推演氨基酸序列第20頁/共22頁為什么進行蛋白質(zhì)測序?

基因組測序,為了破譯遺傳密碼.現(xiàn)在密碼已破,那進行蛋白質(zhì)組測序有必要嗎?

基因研究貫穿了整個20世紀,100多年里,雙螺旋結構的提出,中心法則的發(fā)現(xiàn),直至基因組的重大突破,使基因研究達到了前所未有的深度與廣度.

然而,基因只是信息的攜帶者,蛋白質(zhì)才是執(zhí)行者.基因組計劃有其固有的局限性,基因組測序是否正確,要從其表達的蛋白來驗證,否則,只是一堆亂碼而已.3.5萬左右基因中一半以上是理論推斷,需要從蛋白質(zhì)角度確認.而且,從蛋白質(zhì)研究的自身發(fā)展來看,我們無法逃避蛋白質(zhì)組表達譜分析,只是時間問題而已.

以前,對蛋白質(zhì)的研究是優(yōu)于基因的,因為PCR,測序自動化使其發(fā)展猛.80年代末,HillenKamp發(fā)展的激光解析質(zhì)譜,FemJ設計的電噴霧質(zhì)譜可以高效,精確的測量生物大分子的質(zhì)量,并測定部分序列,進而用于數(shù)據(jù)庫的檢索.MannM等再此基礎上通過建立"肽質(zhì)量指紋圖譜與肽