微生物限度檢查法1．微生物限度檢查法概述2．我國藥品微生物限度標準的發(fā)展情況3．我國藥品微生物限度檢驗方法的發(fā)展情況4．微生物限度檢查法所需的材料5．微生物限度檢查試驗用物品的準備6．無菌室技術(shù)要求7．細菌、霉菌與酵母菌的檢查方法供試品的抽樣、保存及檢驗量試驗操作前的準備供試液的制備對照用菌液的制備菌數(shù)測定陰性對照試驗細菌、霉菌（酵母菌）檢驗程序供試液的稀釋（10倍遞增稀釋法）注平皿傾注培養(yǎng)基培養(yǎng)菌落計數(shù)菌數(shù)報告規(guī)則注意事項8.細菌、霉菌（酵母菌）的其他檢查方法①管稀釋法（試管法、MPN法）②濾膜法③計數(shù)板法④儀器法⑤平板涂布法1．微生物限度檢查法的意義藥品是防病治病、關(guān)系用藥者生命健康的特殊商品，必須保證其質(zhì)量，用藥的安全與有效。微生物污染藥品引起的藥源性疾病屢見不鮮，在國內(nèi)外均有報道。為保證藥品質(zhì)量，必須對微生物污染進行必要的控制和檢驗。其意義在于：已有許多實例表明，藥品污染微生物不僅危及病人用藥安全，而且也直接影響藥品的有效性，所以藥品衛(wèi)生質(zhì)量是藥品質(zhì)量不可分割的部分。反映藥品生產(chǎn)工藝的科學(xué)性、合理性及質(zhì)量管理水平。通過檢驗，凡工藝條件、生產(chǎn)管理水平、生產(chǎn)人員的素質(zhì)差，不注意文明生產(chǎn)的單位和企業(yè)，其生產(chǎn)的藥品，染菌必然嚴重，不合格率無疑就高。微生物限度的檢驗是提供藥品衛(wèi)生質(zhì)量狀況的重要依據(jù)，因而保證銷售與使用過程中藥品的有效性與安全性，是促進與提高生產(chǎn)單位全面質(zhì)量管理水平與提高藥品質(zhì)量的重要依據(jù)。微生物限度檢查法概述2．微生物限度檢查的范圍根據(jù)藥品使用的要求，可劃分為兩大類：規(guī)定滅菌的藥品：包括注射劑和輸液劑，及用于體腔、嚴重?zé)齻?、潰瘍、出血及眼科用藥等制劑。非?guī)定滅菌藥品：包括常用的口服制劑與一般外用制劑。對這一部分制劑一般不要求絕對無菌，允許一定限量的微生物存在，但同時規(guī)定不得有可疑致病的細菌存在。由于致病菌的范圍很廣，各國藥典都規(guī)定了幾個常見的致病菌或指標菌作為控制菌。在非規(guī)定滅菌的制劑中，對每克或每毫升的藥品按劑型或品種不同規(guī)定：染菌量檢查：包括細菌數(shù)、霉菌數(shù)及酵母菌數(shù)測定，以檢查這幾類微生物對藥品的污染程度。控制菌檢查：包括大腸埃希菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌的檢查等。3．藥品微生物限度檢查抽樣量與檢驗量藥品微生物限度檢驗中的困難，最根本的原因在于檢驗對象本身的特殊性。藥品微生物限度檢驗對象的特性：不確定性：藥品受外來微生物的污染，這種污染是可無可有；在有中又可多可少；其種類可以多樣。污染的情況可依生產(chǎn)、設(shè)備、原材料、管理、劑型等條件而定，非藥品本身所固有。所以微生物限度檢查的對象是不確定的。藥品所規(guī)定的檢查項目，除無菌檢查、熱原檢查具有上述性質(zhì)，其他項均無此特征。這一點往往被忽視。污染對藥品而言是一個意外事件。污染批號中的不合格品是一個隨機變量。分布的不均勻性：不均勻性是不確定性的另一種表現(xiàn)形式，在一個批號內(nèi)產(chǎn)品有的被污染，有的不被污染，分布不勻；在被污染的部分中有的數(shù)量極多，有的較少，種類上可以復(fù)雜或較單一。這種不均勻性源于污染源的復(fù)雜性；原輔料污染、工藝污染、空間污染以上表明抽樣方法、抽樣數(shù)量、抽樣次數(shù)均影響測定結(jié)果。以控制菌檢驗為例，決定染菌檢出與否必須具備兩個條件：（A）樣品是否是含染菌的樣品；（B）檢驗操作正確無誤，其中（A）是前提條件。中國藥典2000年版關(guān)于抽驗方法與抽樣數(shù)量規(guī)定：供試品為隨機抽樣，一般抽樣量為檢驗用量（兩個以上最小包裝單位）的3倍量。對異常的供試品應(yīng)針對性的抽樣，對外觀可疑污染或?qū)τ袪幾h復(fù)驗的樣品應(yīng)抽取可以污染和有爭議復(fù)驗的原樣品。對異常的供試品應(yīng)針對性的抽樣，對外觀可疑污染或?qū)τ袪幾h復(fù)驗的樣品應(yīng)抽取可以污染和有爭議復(fù)驗的原樣品。凡能從藥品、瓶（外蓋內(nèi)側(cè)及瓶口周圍）外觀看出發(fā)霉、生蟲以及變質(zhì)的藥品不必再繼續(xù)檢驗，應(yīng)直接判為不合格。不能以有時外觀有上述情況而檢驗內(nèi)容為合格，來判定該藥品合格，因為瓶口染菌，對服用者是不安全的，如自瓶口直接服藥時，所染菌隨之進入人體，同時發(fā)現(xiàn)瓶口一旦染菌，瓶內(nèi)藥液最終要受到污染。檢驗量與抽樣量是兩種不同范疇的量，后者指從全批產(chǎn)品（或抽樣全過程）抽取的單位包裝，前者是指檢驗用量，一般抽樣量大于檢驗量。檢驗量只是抽樣量各包裝的混合樣品的一部分。中國藥典2000年版規(guī)定檢驗量為每次最少應(yīng)分取兩瓶（盒）以上的樣品共10克或10毫升，中藥蜜丸至少應(yīng)分取4丸以上共10克。目前我國以1克或1毫升、膜劑以10cm2作為報告單位；英美藥典及歐洲藥典也是以1克或1毫升作為限量，但控制菌有的是以10克或10毫升作為限量，比我國的限量規(guī)定嚴格。總之，抽樣量和檢驗量大小對檢驗結(jié)果影響較大（盡管目前抽樣方案還存在不科學(xué)，漏檢率高）。由于藥品微生物檢驗是破壞性檢驗，檢驗1瓶（盒）會破壞1瓶（盒），檢驗量愈大，則破壞性愈大，尤其對貴重藥品，生產(chǎn)單位、經(jīng)營單位損失也就越大。因此，如何確定適宜的既能滿足抽樣檢驗基本要求，又能使生產(chǎn)、經(jīng)營者可接受的抽樣方案，是目前需要解決的問題。但目前的規(guī)定必須遵循，不能隨意變動，尤其不能減少（除對貴重、微量包裝的藥品可酌情減少檢驗量除外）。微生物限度檢驗方法的發(fā)展情況

1．1980年我國藥品微生物限度檢驗工作正式發(fā)行《藥品衛(wèi)生檢驗方法》。2．1984年出版第二版《藥品衛(wèi)生檢驗方法》。3．1990.12年中檢所出版第三版，主要對原《方法》中各地反映意見較多的問題進行了改寫；增加了部分檢驗方法和供試液的制備方法；為了同國內(nèi)外檢驗方法相協(xié)調(diào)，對某些內(nèi)容作了相應(yīng)的更改，此外，還參照國家標準的編寫格式作了編排。4．1990年版藥典第二增補本收載了微生物限度檢查法。這也是我國首次在藥典上收載此方法。5．1995年版藥典也收載了此檢查法，少數(shù)劑型收載了限度規(guī)定。（20個化學(xué)藥品規(guī)定限度）。微生物限度標準發(fā)展情況

1．1972年開展此項工作2．1978年頒布我國第一個“藥品衛(wèi)生標準”3．1986年頒布修改后的“藥品衛(wèi)生標準”，1987年12月1日起供內(nèi)部執(zhí)行4．1989年下達“藥品衛(wèi)生標準補充規(guī)定和說明”5．1990年版藥典第二增補本收載了20個化學(xué)藥品種的微生物限度標準規(guī)定，與國際慣例一致6．1995年版藥典少數(shù)幾個劑型（滴眼劑等）收載了微生物限度。規(guī)定按微生物限度檢查法檢查不得有菌生長7．2000年版藥典按劑型、中西藥分類規(guī)定微生物限度，還對幾個生化藥品在各論中項下作了具體規(guī)定實

驗

所

用

的

培

養(yǎng)

基營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（YPD）膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL）4－甲基傘形酮葡糖苷酸蛋白胨培養(yǎng)基（MUG）乳糖培養(yǎng)基5％乳糖培養(yǎng)基蛋白胨水培養(yǎng)基磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基枸櫞酸鹽培養(yǎng)基曙紅亞甲藍瓊脂（EMB）麥康凱瓊脂（MacC）營養(yǎng)肉湯微生物限度檢查常用檢驗設(shè)備及器材

恒溫培養(yǎng)箱30～35℃36±1℃霉菌培養(yǎng)箱25～28℃恒溫水浴箱45±1℃凈化工作臺生物顯微鏡1500X體視顯微鏡或放大鏡電冰箱電熱干燥箱250～300℃高壓蒸汽消毒器電子天平或藥物天平感量0.1g勻漿儀或研缽錐形瓶100ml，250ml，500ml，1000ml乙醇燈康氏振蕩器離心機500～4000／min紫外燈365nm玻璃或搪瓷消毒缸（帶蓋）大、小橡皮乳頭乙醇棉球或碘伏棉球滅菌剪刀、鑷子、鋼錐滅菌稱樣紙滅菌不銹鋼藥匙火柴、記號筆（玻璃鉛筆）白瓷盤、洗手盆實驗記錄紙細菌、霉菌與酵母菌的檢查方法

（平皿菌落計數(shù)法）

（一）供試品的抽樣、保存及檢驗量1．

供試品應(yīng)隨機抽樣。一般抽樣量（2個以上最小包裝單位）為檢驗量的3倍量。2．對異常的供試品應(yīng)針對性的抽樣。抽樣時，凡發(fā)現(xiàn)有異?；蚩梢傻臉悠?，應(yīng)選取有疑問的樣品，但機械損傷、明顯破裂的包裝不得作為樣品。凡能從藥品、瓶口（外蓋內(nèi)側(cè)及瓶口周圍）、外觀看出長螨、發(fā)霉、蟲蛀及變質(zhì)的藥品，可直接判為不合格，無需在抽樣檢驗。不能以外觀有上述情況而檢查內(nèi)容物合格，來判斷該藥品合格。3．供試品收檢后應(yīng)及時檢驗，若有困難，應(yīng)存放在該品種規(guī)定的儲存條件下（一般為陰涼干燥處），勿冷藏或冷凍，以防供試品內(nèi)污染菌因保存條件不妥引起致死、損傷或繁殖。4．供試品在檢驗之前，應(yīng)保持原包裝狀態(tài)，嚴禁開啟，包裝已開啟的樣品不得作為供試品。5．供試品的取樣必須在凈化條件下無菌操作，嚴防再污染。（原料藥、裝量大的藥）6．有劑型檢驗量均需取自2個以上包裝單位（中藥蜜丸、膜劑，除需取自2個以上包裝外，還應(yīng)取4丸、片以上樣品）。7．固體及半固體（粘稠性供試品）制劑檢驗量為10克。8．液體制劑檢驗量為10毫升。9．膜劑除另有規(guī)定外，中藥膜劑檢驗量為30～50cm2，化學(xué)膜劑及生化藥膜劑檢驗量為100cm2。10．貴重的或微量包裝的供試品檢驗量可以酌減，除另有規(guī)定外，口服固體制劑不低于3克，液體制劑采用原液者不得少于6毫升，采用供試液者不得少于3毫升，外用藥品不得少于5克64．操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦拭供試品瓶、盒、袋等的開口處周圍，待干后用滅菌的手術(shù)鑷或剪將供試品啟封。（三）供試液的制備（1：10供試液）按供試品的理化特性與生物學(xué)特性采取適宜的方法制備供試液。不得改變污染微生物的數(shù)量和種類。1．液體供試品取供試品10ml，加入到稀釋劑90ml中，混勻，作為供試液。（有的書上講取10ml，置滅菌錐形瓶中，加入90ml稀釋劑，搖勻）。①

油劑可加適量聚山梨酯－80；

②氣霧劑、噴霧劑供試品將供試品置冰室內(nèi)2hr后，取出，用滅菌鋼錐小心鉆孔，使拋射劑緩慢釋放，然后用滅菌注射器加入稀釋劑，混勻后吸取相當于10g或10ml供試品，再稀釋成1：10供試液。USPXXIV規(guī)定是拋射劑導(dǎo)出后，吸取10ml或取10g供試品，加稀釋液使成100ml。③合劑（系指含蜂蜜或王漿者）與滴眼劑可用供試品作為供試液。（滴眼劑不得檢出霉菌和酵母菌）。含蜂蜜、王漿的制劑2．固體、半固體或粘稠供試品稱取供試品10g，置裝有0.9％無菌氯化鈉100ml的勻漿杯中，用勻漿儀（3000～5000r／2－4min），或其他適宜方法（振蕩器或研缽研磨等方法分散混勻，作為供試液。在制備過程中，必要時可加適量聚山梨酯－80，并適當加溫，但不應(yīng)超過45℃。3．非水溶性供試品①軟膏劑、乳化劑稱取供試品5g(5ml)，加入含已滅菌熔化并保溫45℃左右的司盤－8050g、單硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯－8010g混合物的燒杯中，用無菌玻棒攪拌成團后，慢慢加入45℃左右的0.9％無菌氯化鈉溶液約80ml，（實際測可能是85ml），邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為供試液（1：20）。②油劑取供試品10ml，加入無菌聚山梨酯－805～8ml，搖勻，再加入稀釋劑至100ml。③栓劑稱取供試品10g，置滅菌錐形瓶中，加適量稀釋劑，置45℃左右水浴保溫10min，使溶，加入無菌聚山梨酯－805～8ml，振搖使之乳化，再加稀釋劑（稀釋劑和聚山梨酯－80總量為100ml），搖勻4．含抑菌成分供試品（僅限檢查控制菌時用）凡含防腐劑或抑菌成分且影響檢驗（供試品按常規(guī)檢查法，加入規(guī)定量的對照菌，不能檢出時）的供試品，可根據(jù)供試品的性質(zhì)，控制菌的特性及檢驗條件等按以下方法之一或兩種以上方法聯(lián)合應(yīng)用處理后，依法檢查。同時做陽性和陰性對照。藥典規(guī)定：供試品如干擾控制菌檢驗，按以下方法處理后，依法檢查。實際操作中：先把供試液離心（500r/min5min）這樣菌體在上層，吸取上清液過濾，把濾膜直接貼在培養(yǎng)基上培養(yǎng)即可，具體吸取上清液10ml還是100ml按品種要求自己定。取10ml過濾測出來的是個／克，取100ml過濾測出來的是個／10克。（限度檢查）①稀釋法：將供試品種入較大量的培養(yǎng)基中，使該供試液稀釋至不具抑菌作用的濃度（使該供試液稀釋至陽性對照菌能生長的濃度）。此法用作控制菌檢查和限度檢查。本法適用于抑菌作用不強的中藥、化學(xué)藥品的檢驗。②離心沉淀集菌法：取規(guī)定量的供試液于無菌刻度離心管中，離心（每分鐘3000轉(zhuǎn)）30分鐘，棄去上清液，留底部集菌液約2ml，再稀釋成原規(guī)定的供試液。如有不溶性藥渣，可先離心（每分鐘500轉(zhuǎn)）5分鐘，取全部上層液，再行集菌處理。本法適用于一些抑菌作用不強的中、西藥品，如蜜丸、水丸、片劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑及液體制劑。應(yīng)用本法需嚴防操作污染，并注意上層液或上清液和底部殘渣的分離，避免沉渣混入其中。③薄膜過濾法：取規(guī)定量的供試液，置稀釋劑100ml中，搖勻，以無菌操作加入裝有直徑約50mm、孔徑不大于0.45um±0.02um的微孔濾膜過濾器中，減壓抽干后，用稀釋劑沖洗濾膜3次，每次50～100ml，取出濾膜備檢。沖洗時每次最好不少于100ml，可以將培養(yǎng)基加入濾器或取出濾膜，加入增菌培養(yǎng)基中，可以用加入濾器中供試品的量來控制檢驗量，也可以把濾膜取出來剪成2～4片，使每片相當于供試品1g或1ml，放入增菌培養(yǎng)基中，作控制菌檢驗。以上兩法適用于難溶于水的抗菌制劑。如磺胺類藥應(yīng)用沉降法時，供試品應(yīng)充分研細，并與稀釋劑充分搖勻，使污染菌分散于液相中；沉降時間不宜超過5分鐘，以防菌細胞下沉；取上清液時，避免吸入藥渣。（四）對照用陽性菌液控制菌檢查均應(yīng)作相應(yīng)已知菌的陽性對照試驗。對照菌株為大腸桿菌［CMCC(B)44102］、沙門菌CMCC(B)50094］、銅綠假單胞菌、［CMCC(B)10104］及金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]制備：取相應(yīng)菌株的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物1白金耳，接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)18～20小時后，稀釋至1：106。對照菌的加入量為50～100個。CMCC――醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心。國內(nèi)藥品微生物檢驗所用的菌種主要是CMCC(B)、CMCC(F)菌號，B(bacteria)代表細菌，F(xiàn)(fungi)代表真菌。中國藥品生物制品檢定所醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心提供這些干燥菌種。（五）平皿菌落計數(shù)法取均勻供試液，進一步稀釋成1：1021：103等適宜的稀釋級。分別取連續(xù)三級10倍稀釋的供試品液各1ml，置直徑約9mm的平皿中，再注入約45℃的培養(yǎng)基約15ml，混勻，待凝固后，倒置培養(yǎng)，每稀釋級應(yīng)作2～3個平皿。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于細菌計數(shù)，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基用于霉菌計數(shù)。在特殊情況下，前者同時點記霉菌、酵母菌菌落數(shù)，后者同時點記細菌菌落數(shù)。酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于酵母菌計數(shù)。含蜂蜜、王漿的制劑用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基與酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基分別測定霉菌、酵母菌菌落數(shù)，合并計數(shù)。含糖的液體及半固體制劑用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基同時點計霉菌菌落數(shù)及酵母菌菌落數(shù)。（六）菌數(shù)測定陰性對照試驗取供試驗用的稀釋劑各1ml，置4個無菌平皿中，分別按細菌、霉菌計數(shù)用的培養(yǎng)基制備平板，培養(yǎng)，檢查，不得長菌。（七）檢驗程序細菌、霉菌（酵母菌）檢驗程序

（八）供試液的稀釋（10倍遞增稀釋法）

取2～3支滅菌試管，分別加入9ml滅菌稀釋劑。另取1支1ml滅菌吸管吸取1：10均勻供試液1ml，加入裝有9ml滅菌稀釋劑的試管中混勻，即得1：100供試液。依此類推，根據(jù)供試品的污染程度，可稀釋至1：103、1：104等適宜稀釋級（至少共三級）。一般取1：101：1021：103三級稀釋液檢驗。每遞增一個稀釋級，必須另換一支吸管。在作10倍遞增稀釋時，吸管插入第1級稀釋液內(nèi)不低于液面2.5cm，反復(fù)吸吹約10次。吸液時，應(yīng)先吸至高于吸管上部刻度少許，然后提起吸管，貼于試管內(nèi)壁調(diào)整液量至刻度，再沿第2支稀釋管的內(nèi)壁靠近液面（勿接觸液面）緩慢地吹出全部供試液（吸管內(nèi)應(yīng)無粘附或殘留液體），然后將吸管放入消毒液缸內(nèi)。（九）注平皿在進行10倍遞增稀釋的同時，以該稀釋級吸管，吸取各級稀釋液各1ml至每個平皿中，每一稀釋劑注2～3個平皿。（此時，一般為左手執(zhí)平皿，將蓋半開，右手執(zhí)吸管），注平皿時，將1ml供試液慢慢全部注入平皿中，管內(nèi)無殘留液體，防止反流到吸管尖端部。同時做陰性對照（待各級稀釋液注皿完成后，用一支1ml吸管吸取稀釋劑各1ml，分別注入4個平皿中。其中兩個作細菌陰性對照；另2個作霉菌、酵母菌陰性對照，如另用YPD瓊脂測定酵母菌數(shù)時，再增加2個平皿作酵母菌數(shù)陰性對照）。（十）傾注培養(yǎng)基將預(yù)先配制好的培養(yǎng)基（細菌計數(shù)用營養(yǎng)瓊脂，霉菌、酵母菌計數(shù)一般用玫瑰紅鈉瓊脂，含蜂蜜、王漿液體制劑另加用YPD瓊脂）溶化，冷至約45℃時，傾注上述各個平皿約15ml，以順時針或反時針方向快速旋轉(zhuǎn)平皿，使試液與培養(yǎng)基混勻，（注意，混勻時切勿將培養(yǎng)基濺到平皿邊及皿蓋上），置操作臺上待凝。（十一）培養(yǎng)細菌計數(shù)平板倒置于30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，霉菌、酵母菌計數(shù)平板于25～28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。（十二）菌落計數(shù)1．細菌培養(yǎng)時間為48小時，分別在24小時及48小時點記菌落數(shù)，一般以48小時菌落數(shù)為準，霉菌、酵母菌培養(yǎng)時間為72小時，分別在48小時及72小時點記菌落數(shù)，一般以72小時菌落數(shù)為準。菌落如蔓延生長成片，此平板不宜計數(shù)。點計后，計算各稀釋級的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報告規(guī)則報告菌數(shù)。2．一般將平皿置菌落計數(shù)器或從平皿的背面直接以肉眼點計，以透射光襯以暗色背景，仔細觀察。勿漏計細小的瓊脂層內(nèi)和平皿邊緣生長的菌落。注意細菌菌落與霉菌菌落和酵母菌菌落以及它們與供試品顆粒、培養(yǎng)基沉淀物、氣泡等的區(qū)別。必要時用放大鏡或用低倍顯微鏡直接觀察或挑取可疑物涂片鏡檢。如仍難區(qū)別，可延長培養(yǎng)時間4～7天，細菌菌落常會生長增大而加以區(qū)別。3．供試品如為微生物制劑，應(yīng)將有效微生物菌落排除，不可點記在細菌、霉菌和酵母菌數(shù)內(nèi)。排除的方法須按該制劑微生物品種而定，并須觀察菌落特征及染色形態(tài)。4．供試品稀釋液常含有不溶性原料、輔料，（特別是1：10級別）培養(yǎng)基注皿后亦可能產(chǎn)生沉淀物，經(jīng)過培養(yǎng)后有時形成數(shù)量很多且難與菌落用肉眼相區(qū)別的有形物。為了有利于菌落計數(shù)，可在操作時將適宜稀釋級的供試液多增加注皿（1～2個平皿），注皿后不經(jīng)培養(yǎng)而放置于冰箱（勿結(jié)凍）中，在計數(shù)菌落時作為對照?；蛴?.001％TTC營養(yǎng)瓊脂注皿，經(jīng)培養(yǎng)后可將細菌菌落與其他有形物區(qū)別開來。［0.001%TTC肉湯瓊脂培養(yǎng)基（0.001%2、3、5氯化三苯四氮唑瓊脂），在每1000ml營養(yǎng)瓊脂內(nèi)加入滅菌的1％TTC溶液1ml混勻后傾注平皿，防止菌落蔓延］。有些軟膏等非水溶性供試品，經(jīng)營養(yǎng)瓊脂注皿后呈乳白色，培養(yǎng)后生長的菌落不易辨認和點計，為防止這種情況，也可用0.001％TTC營養(yǎng)瓊脂注皿，經(jīng)培養(yǎng)后生長的菌落為紅色，襯以白色背景上易于點計。5．若平板上有2個或2個以上菌落重疊，肉眼可辨別時仍以2個菌落或2個以上菌落計數(shù)；若平板生長有鏈狀菌落，菌落間無明顯界限，一條鏈作為一個菌落計，但若鏈上出現(xiàn)性狀與鏈狀菌落不同的可辨菌落時，仍應(yīng)分別計數(shù)，若生長蔓延較大的片狀菌落或花斑樣菌落，一般不宜作為計數(shù)用。附表：細菌、霉菌、酵母菌形態(tài)特征比較（營養(yǎng)瓊脂及玫瑰紅鈉瓊脂平板）

6．如同一稀釋級2個平板菌落數(shù)超過1倍以上，不應(yīng)計數(shù)，菌落蔓延成片不應(yīng)計數(shù)。7．當2個平板菌落數(shù)均在15（含15）以下時，按菌落計數(shù)的Poisson分布菌數(shù)的95%可信限計。二個平板最大差值分別在0～4，1～7，2～9，3～10，4～12，5～14，6～15，以上各數(shù)分別為菌落平均值1、2、3、4、5、6、7的上限及下限，超出以上限度，視為操作誤差，不得作為計數(shù)依據(jù)。每個稀釋級使用3個平板時，平板菌落數(shù)均在10個以下的情況。0～3，1～5，2～7，3～9，4～10，5～12，6～13，7～14。8．對有疑議的供試品以YPD培養(yǎng)基作酵母菌計數(shù)時，可培養(yǎng)至1周再點計菌落數(shù)。（十三）菌數(shù)報告規(guī)則1．細菌數(shù)選取平均菌落數(shù)在30～300（國外近年有選取25～250的趨向）之間的稀釋級，霉菌、酵母菌選取平均菌落數(shù)在30～100之間的稀釋級作為報告菌數(shù)計算的依據(jù)。如只有1個稀釋級平均菌落數(shù)在30～300（30～100）之間，則將該稀釋級的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告。2．如有2個相鄰稀釋級平均菌落數(shù)在30～300（30～100）之間時，則按比值計算。當比值≤2時，則以2個稀釋級的均值報告。當比值＞2時，則以低稀釋級的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告。比值＝（高稀釋級平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)）／（低稀釋級平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)）3．如有3個稀釋級平均菌落數(shù)均在30～300（30～100）之間時，則以后2個稀釋級計算級間比值報告。4．如各稀釋級平均菌落數(shù)均在300（100）以上，則按最高稀釋級平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告；如各稀釋級平均菌落數(shù)均在30以下，一般則按最低稀釋級平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告。5．如各稀釋級平均菌落數(shù)均不在30～300（30～100）之間，則以最接近30或300（100）的稀釋級平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告。6．如各稀釋劑的平板均無菌落生長或僅最低稀釋級平均菌落數(shù)小于1時，則報告菌數(shù)為小于10個／g或ml。如供試品原液平板均未生長霉菌及酵母菌，則報告未檢出霉菌及酵母菌／ml。7．當各稀釋級平均菌落數(shù)均小于30時，如高稀釋級平均菌落數(shù)大于或等于低稀釋級平均菌落數(shù)時，應(yīng)以培養(yǎng)基稀釋法重新測定，按測定結(jié)果報告菌數(shù)。

培養(yǎng)基稀釋法：取低稀釋級供試液（原液或1：10供試液）3份，每份各1ml，分別注入5個或5個以上平皿中（每皿0.2ml或＜0.2ml)，每1個平皿傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約15ml，混勻，凝固后，倒置培養(yǎng)，計數(shù)。5個或5個以上平板點計的菌落數(shù)之和，即為每1ml菌落數(shù)，共得3組數(shù)據(jù)。以3份低稀釋級供試液菌落數(shù)的平均值乘以稀釋倍數(shù)報告。8．結(jié)果報告①

菌落數(shù)在100以內(nèi)時，按實有數(shù)報告。②

菌落數(shù)大于100時，取兩位有效數(shù)字報告，第三位按數(shù)值修約規(guī)則處理。③

復(fù)試供試品細菌數(shù)、霉菌數(shù)及酵母菌數(shù)其中任一項一次檢驗不合格，應(yīng)重新取2倍包裝量供試品，依法作單項復(fù)試兩份，以三次檢驗結(jié)果的平均值報告。（十四）注意事項1．供試品檢驗全過程必須符合無菌技術(shù)要求。使用滅菌用具時，不能接觸可能污染的任何器物，滅菌吸管不得用口吹吸。2．從供試品稀釋至傾注瓊脂培養(yǎng)基操作應(yīng)在1小時內(nèi)完成，避免由于時間過長導(dǎo)致菌細胞繁殖或死亡。3．供試液稀釋及注皿應(yīng)取均勻的供試液，以免造成實驗誤差。4．為避免細菌菌落蔓延生長，宜采取下列方法處理：開蓋干燥換陶瓦蓋加TTC(0.001%)5．在凈化工作臺上操作時，應(yīng)避免雙手來回出入工作臺；在無菌室操作時，應(yīng)避免操作者來回出入無菌室。

細菌、霉菌及酵母菌的其他檢驗方法

（一）

細菌計數(shù)其他測定方法細菌計數(shù)除平板菌落計數(shù)法外，還有其他方法，大體上可分兩大類：1．活菌計數(shù)包括試管稀釋法、濾膜法、毛細血管法等前者是液體培養(yǎng)法，后兩者是固體培養(yǎng)法。其特點都是檢測具有繁殖能力的細菌數(shù)。2．總菌數(shù)計數(shù)法是以細菌（或其它菌類）的形態(tài)特征檢測細菌總數(shù)，包括無生殖能力的菌細胞在內(nèi)。試管稀釋法（試管法、MPN法）濾膜法（BP、JP已收載此法）計數(shù)板法（采用血球計數(shù)板或其它計數(shù)板進行細菌計數(shù)）儀器法（應(yīng)用儀器測定菌數(shù)是現(xiàn)代菌數(shù)檢測技術(shù)的一種發(fā)展動向。細菌細胞則屬不導(dǎo)電的粒子，可被計數(shù)）平板涂布法（二）

霉菌、酵母菌數(shù)測定的其他方法1．表面涂抹平板法本法適用于污染比較嚴重的供試品2．濾膜培養(yǎng)法3．酵母菌鏡檢計數(shù)法血球計數(shù)板或其它的計數(shù)板進行酵母菌計數(shù)

大

腸

桿

菌

檢

查

法

大腸桿菌即大腸埃希菌(Escherichiacoli)，為腸桿菌科埃希菌屬的模式種。埃希菌屬除大腸埃希菌外，新近發(fā)現(xiàn)有非脫羧埃希菌等四個種（有的資料說五種）。大腸埃希菌是人和溫血動物腸道內(nèi)的棲居菌，隨糞便排出體外。在藥品中檢出大腸桿菌，表明該樣品受到了人和溫血動物糞便污染，即可能污染腸道病原體。大腸埃希菌除普通大腸桿菌外尚有致病性大腸桿菌，可引起嬰幼兒、成人爆發(fā)性腹瀉。為保證人體健康，口服藥品必須檢查大腸桿菌。用4－甲基傘形酮葡糖苷酸(4－Methylumbelliferyl－β－D－glucuronide，即MUG)和靛基質(zhì)（Indole）試驗檢驗大腸桿菌是一項新技術(shù)，專一性強，試驗證明94％大腸埃希菌MUG陽性，且在大腸埃希菌屬中，除E.coli以外，其他5種大腸埃希桿菌MUG皆為陰性。其檢驗步驟為：增菌培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)種MUG蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)，多數(shù)情況下不需要從混合菌種分離單個菌，如MUG、Indole試驗為陽性或陰性即可報告結(jié)果，如MUG、Indole試驗不一致時，則需分離培養(yǎng)、革蘭染色、鏡檢及生化試驗鑒別。原理：利用目標菌限定酶作用的低物的水解產(chǎn)物，產(chǎn)生顏色或熒光反應(yīng)作為指標系統(tǒng)來鑒定目標菌。試驗證明96％的大腸桿菌含β－葡糖苷酸酶（β－glucuronidase,GUD），約10％的沙門菌屬一些菌種也含有此酶。MUG被GUD水解，產(chǎn)生熒光，由于熒光反應(yīng)的敏感度較顏色反應(yīng)強千萬倍，易于觀察，沒有主觀性，因而用MUG鑒定大腸桿菌已被廣泛應(yīng)用于臨床、食品、飲水、污水等的檢測。單一的MUG鑒別大腸桿菌其漏檢率達6％，這不符合藥典檢查方法的準確度要求，鑒于98％的大腸桿菌靛基質(zhì)試驗為陽性，故將MUG－靛基質(zhì)試驗結(jié)合，用EMB瓊脂平板分離，輔以IMViC試驗，在理論上可使大腸桿菌的檢出率達99％。（一）大腸桿菌檢驗程序（見下頁圖表）供試液的制備方法：1．液體供試品2．固體、半固體或粘稠液體供試品3．非水溶性供試品4．含抑菌成分的供試品（稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法、沉降法）（二）增菌培養(yǎng)取膽鹽乳糖（BL）培養(yǎng)基3份，每份各100ml，2份分別加入規(guī)定量的供試液，其中1份加入對照菌50～100個作陽性對照，第3份加入與供試液等量的稀釋劑作陰性對照。37℃培養(yǎng)18～24小時（必要時可延長至48小時）。陰性對照應(yīng)無菌生長。搖勻上述膽鹽乳糖增菌液，以滅菌吸管吸取供試品膽鹽乳糖增菌液、供試品陽性對照增菌液、陰性對照培養(yǎng)液各0.2ml，分別加入5mlMUG－蛋白胨培養(yǎng)基管，37℃培養(yǎng)，分別于5小時、24小時，取未接種的MUG培養(yǎng)基管作本底對照，將各管置365nm紫外燈下觀察。陽性對照管呈現(xiàn)熒光，MUG陽性，供試液的MUG管呈現(xiàn)熒光，MUG陽性；無熒光，MUG陰性。然后加數(shù)滴靛基質(zhì)試液于MUG管內(nèi)，液面呈玫瑰紅色為陽性，呈試劑本色為陰性。（三）分離培養(yǎng)如MUG陽性、靛基質(zhì)陰性或MUG陰性、靛基質(zhì)陽性時，將上述供試品BL大

腸

桿

菌

檢

驗

程

序

圖

示

增菌液輕輕搖動，以接種環(huán)沾取1～2環(huán)培養(yǎng)液劃線于EMB或麥康凱瓊脂平板上，培養(yǎng)18～24小時。當陰性對照呈陰性，陽性對照的平板呈典型菌落生長時，如上述供試液培養(yǎng)物的分離平板無菌落生長，判未檢出大腸桿菌。如果有菌落生長，應(yīng)挑選2～3個可疑菌落作靛基質(zhì)試驗（I）、甲基紅試驗（M）、乙酰甲基甲醇生成試驗（V－P）、枸櫞酸鹽利用試驗（C）及革蘭染色，鏡檢。按表中規(guī)定判斷結(jié)果：（見下頁）大腸桿菌菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基菌落形態(tài)

曙紅亞甲藍瓊脂（EMB）典型菌落呈紫黑色，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤，有金屬光澤。非典型菌落呈淺紫色、粉紅色，或菌落中心紫色或無明顯暗色中心，無金屬光澤。麥康凱瓊脂

典型菌落呈鮮桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤。非典型菌落呈微紅色，或菌落中心呈紅色。

（四）純培養(yǎng)（復(fù)壯）如生長菌落與（大腸桿菌菌落形態(tài)特征表）所列特征相符或疑似者，以接種針輕輕接觸單個疑似菌落的表面中心，沾取培養(yǎng)物，應(yīng)挑選2～3個以上疑似菌落，分別接種營養(yǎng)瓊脂斜面，培養(yǎng)18～24小時，作以下檢查。如平板上無單個可疑菌落，但有可疑菌團（紫黑色，或有金屬光澤），應(yīng)沾取可疑菌團培養(yǎng)物少許，或重新取增菌培養(yǎng)液劃線接種于EMB瓊脂平板，培養(yǎng)18～24小時，在挑選單個疑似菌落，純培養(yǎng)，作以下檢查。（五）革蘭染色、鏡檢1．以接種環(huán)沾取無菌水于潔凈載玻片上，取上述疑似菌落的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許，輕輕研開，制成均勻涂片，自然或微溫干燥，再通過火焰2～3次（載玻片不燙手為宜）固定。2．滴加結(jié)晶紫染液，染色1分鐘，水洗3．滴加碘液，媒染1分鐘，水洗，以濾紙吸干余水4．滴加95％乙醇，脫色20～30秒，水洗?；?qū)?5％乙醇滴滿整個涂片，立即傾去，再用乙醇滴滿涂片脫色10秒，水洗、吸干5．滴加沙黃染液，復(fù)染1分鐘，待干后，鏡檢染色結(jié)果：革蘭陽性菌呈藍紫色；革蘭陰性菌呈紅色。大腸桿菌為革蘭陰性短桿菌，或球桿菌狀，亦有桿菌狀。注意事項：1．玻片必須潔凈，涂片菌量宜少，菌量不可濃，否則，菌細胞成堆或連成片。看不清單個菌體形態(tài)。染色反應(yīng)難于判斷，菌細胞形態(tài)難于觀察。2．待檢菌菌齡以16～24小時為宜。革蘭陽性菌易受菌齡影響，老化細胞易呈陰性。3．脫色是本法的關(guān)鍵步驟，脫色時間不足菌細胞易染成陽性，脫色時間過長易染成陰性。（六）生化試驗1．靛基質(zhì)試驗（I）取上述斜面培養(yǎng)物，接種于蛋白胨水培養(yǎng)基，培養(yǎng)24～48小時，沿管壁加入靛基質(zhì)試液數(shù)滴，輕輕搖動試管，液面呈玫瑰紅色為陽性，呈試劑本色為陰性。98％的大腸桿菌I試驗為陽性。一般24小時即可出現(xiàn)陽性結(jié)果，以無菌操作先從管中取出1ml或2ml培養(yǎng)液進行檢查，如靛基質(zhì)試驗是陰性，余下的蛋白胨水培養(yǎng)物再培養(yǎng)24小時，作靛基質(zhì)試驗。2．甲基紅試驗(M)取可疑菌落或斜面培養(yǎng)物，接種磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48小時±2小時，于管內(nèi)加入甲基紅指示液2～3滴（約每1ml培養(yǎng)液加指示液1滴），輕微搖動，立即觀察，呈鮮紅色或橘紅色為陽性，呈黃色為陰性。3．乙酰甲基甲醇生成試驗(V－P)取可疑菌落或斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48小時±2小時，于每2ml培養(yǎng)液中加入α－萘酚乙醇試液1ml，混勻，再加40％KOH溶液0.4ml，充分振搖，在4小時（通常在30min）內(nèi)出現(xiàn)紅色應(yīng)判為陽性，無紅色反應(yīng)為陰性。4．枸櫞酸鹽利用試驗(C)取可疑菌落或斜面培養(yǎng)物，接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基的斜面上，一般培養(yǎng)48～72小時，培養(yǎng)基斜面有菌落生長，培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{色時為陽性，培養(yǎng)基顏色無改變?yōu)殛幮?。（七）注意事?．本法（MUG法）不必從混合菌中分離單個菌落。除大腸埃希菌外，尚有部分志賀菌屬、沙門菌屬的菌株；亦有極少數(shù)革蘭陽性球菌、桿菌和芽孢菌，其MUG為陽性。因此在MUG培養(yǎng)基成分中增加了去氧膽酸鈉，可排除革蘭陽性菌的干擾。至于志賀菌、沙門菌在膽鹽乳糖培養(yǎng)基中較難生長，即使有生長，本法能檢出。既然藥品中不得檢出大腸桿菌，更不允許檢出志賀菌、沙門菌。2．配制MUG培養(yǎng)基時，務(wù)必校正PH值，滅菌后PH不得過7.4，否則PH值偏高，MUG管本身分解則顯熒光，分裝MUG培養(yǎng)基的試管應(yīng)挑選，試管本身不得顯熒光。3．培養(yǎng)時間供試品培養(yǎng)液接種于MUG培養(yǎng)基中的培養(yǎng)時間，一般在5小時、24小時觀察是否產(chǎn)生熒光，如熒光很微弱，不能準確判斷時，可延長培養(yǎng)至48小時再觀察結(jié)果。由于大腸埃希菌各菌株間的GUD（β－葡萄糖醛酸苷酶）的活性不完全相同，對低物和低物的濃度反應(yīng)的差異；培養(yǎng)基中選擇因子的影響；培養(yǎng)時間、溫度；PH的改變；大量競爭菌和樣品本身物質(zhì)成分的干擾等，對結(jié)果的判斷亦有影響。4．結(jié)果觀察取供試品的MUG試驗管、陽性對照管、陰性對照管同時在365nm紫外燈下觀察，陽性對照管應(yīng)有較強藍白色熒光，陰性對照管無熒光。供試品MUG管是否有熒光，應(yīng)仔細觀察比較，或?qū)⒏鞴苷{(diào)換位置（陰性管居中間），適當傾斜試管。如陽性對照管熒光強烈，影響供試品管與陰性對照管的觀察時，亦可移去陽性對照管。5．藥品中污染的大腸桿菌，亦受生產(chǎn)工藝及藥物的影響。在曙紅亞甲藍瓊脂或麥康凱瓊脂平板上的菌落形態(tài)特征時有變化，挑取可疑菌落往往憑經(jīng)驗，主觀性較大，務(wù)必挑選2～3個以上菌落分別做IMViC試驗鑒別，挑選菌落越多，檢出陽性菌的機率越高，如僅挑選一個菌落做IMViC試驗鑒別，則易漏檢。6．在IMViC試驗中，以滅菌接種針沾取菌苔，首先接種于枸櫞酸鹽瓊脂斜面上，然后接種于蛋白胨水培養(yǎng)基、磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中。且勿將培養(yǎng)基帶入枸櫞酸鹽瓊脂斜面上，以免產(chǎn)生假陽性結(jié)果。枸櫞酸鹽利用培養(yǎng)時間，原定為2天，根據(jù)試驗資料，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)3天后，枸櫞酸鹽利用試驗產(chǎn)生陽性。僅培養(yǎng)2天是不夠的，故實驗培養(yǎng)時間改為2～4天（藥典規(guī)定48～72小時）。7．陽性對照試驗是檢查供試品是否有抑菌作用及培養(yǎng)條件是否適宜。陽性對照菌液的制備、計數(shù)及加入含供試品的培養(yǎng)基中等操作，不能在檢測供試品的無菌室或凈化臺上進行，必須在單獨的隔離間或凈化臺操作，以免污染供試品及操作環(huán)境。8．在各類供試品中檢測大腸桿菌及其他控制菌，按一次檢出結(jié)果為準，不再抽樣復(fù)驗。檢出的大腸桿菌及其他控制菌培養(yǎng)物須保留備查。（一般保留1個月）9．大腸埃希桿菌（E.coli）是大腸埃希桿菌屬中一種細菌，已知大腸埃希菌屬有6種，其中IMViC試驗?zāi)Ｊ綖椋D―或－＋――。故中國藥典大腸埃希桿菌檢查法所指的IMViC試驗結(jié)果與BP1998的E.coli檢查法比較，判斷檢出或未檢出大腸埃希桿菌，均有其局限性。BP1998法中含IMViC試驗為＋＋――的菌株但BP1998法中不含IMViC試驗為－＋――的菌株附：典型大腸桿菌＋＋――非典型大腸桿菌－＋――典型中間型大腸桿菌＋＋―＋非典型中間型大腸桿菌－＋―＋典型產(chǎn)氣腸桿菌――＋＋非典型產(chǎn)氣腸桿菌＋―＋＋

沙門菌檢查法

（見

頁）

銅綠假單胞菌檢查法（見

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金黃色葡萄球菌檢查法（見頁）

破傷風(fēng)梭菌檢查法

（見

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微生物限度檢查法結(jié)果判斷

（一）細菌菌落數(shù)、霉菌（酵母菌）菌落數(shù)、控制菌三項均符合該品種微生物限度項下規(guī)定，應(yīng)判為供試品符合規(guī)定；其中任何一項不符合該品種項下規(guī)定，應(yīng)判供試品不合格。（二）細菌菌落數(shù)、霉菌（酵母菌）菌落數(shù)第一次測定結(jié)果超過該品種項下規(guī)定時，應(yīng)從同一批號樣品中隨機抽樣，復(fù)試2次，以3次結(jié)果平均值報告。（三）眼科用藥的霉菌和酵母菌菌落數(shù)復(fù)試報告，須以2次復(fù)試結(jié)果均不得長菌，方可判供試品合格。（四）如營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板生長霉菌（酵母菌）菌落數(shù)或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上生長細菌菌落數(shù)超過該品種項下微生物限度規(guī)定時，經(jīng)復(fù)試2次，如3次結(jié)果平均值仍超過規(guī)定，應(yīng)判供試品不合格。（五）各類制劑檢出控制菌或其他致病菌時，按一次檢出結(jié)果為準，不再抽樣復(fù)試，即應(yīng)判該供試品不符合規(guī)定。沙

門

菌

檢

驗

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序銅

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單

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菌

檢

驗

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序無

菌

室

技

術(shù)

要

求微生物限度及無菌檢查實驗室條件應(yīng)滿足工作任務(wù)的要求，有完善的實驗設(shè)施和管理制度。在未普遍采用現(xiàn)代化的無菌隔離器技術(shù)之前，無菌實驗室仍是最常用的無菌環(huán)境之一。1.

無菌室的建筑設(shè)計應(yīng)充分考慮其合理布局，使用方便，操作安全等條件。應(yīng)設(shè)在較潔凈的環(huán)境內(nèi)。遠離交通干道、廁所及污染區(qū)，最好在二樓以上，應(yīng)選上下水道及其他安裝適宜的位置。2.專用無菌室無菌檢查、微生物限度檢查與抗生素微生物檢定用實驗室，應(yīng)嚴格分開，具危險性的毒菌、毒素如破傷風(fēng)梭菌、黃曲霉素需單獨使用，以便控制、防止傳播。3、

無菌室操作間面積不超過10m2、高不超過2.4m4、室內(nèi)六面應(yīng)光滑平整、無縫隙，不起灰不落