畢業(yè)論文

申請人：王麗媛醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系09級（本)19班18號指導(dǎo)教師：沈薇S100A4基因真核表達(dá)載體構(gòu)建及其在細(xì)胞中的表達(dá)前言實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果討論參考文獻(xiàn)前言胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。目前胃癌的治療方法主要為手術(shù)及輔助化療，但傳統(tǒng)的化療副作用大，研發(fā)新的輔助治療方法對胃癌治療具有重要意義。深入研究胃癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制，將有助于研發(fā)更有效的診斷及治療方法。前言S100A4蛋白是S100蛋白家族的成員之一，由101個(gè)氨基酸組成，分子量約11kDa。S100A4的表達(dá)可見于多種人類腫瘤，其表達(dá)與胃癌浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但S100A4基因在胃癌中的作用機(jī)制仍不十分清楚。

本研究擬通過RT-PCR與基因重組技術(shù),構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1-S100A4,轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系MKN1,為深入研究S100A4對胃癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及在胃癌發(fā)病中的作用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。前言前言實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果討論參考文獻(xiàn)實(shí)驗(yàn)材料人胃粘膜上皮細(xì)胞系GES-1；人胃癌細(xì)胞系MKN1克隆載體pMD18-TsimpleVector;真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）

大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞TRIZOLReagent;反轉(zhuǎn)錄試劑盒；PCRKit;膠回收純化試劑盒;質(zhì)粒提取試劑盒

脂質(zhì)體LipofectamineTM2000;限制性核酸內(nèi)切酶RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清前言實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果討論參考文獻(xiàn)實(shí)驗(yàn)方法S100A4基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在細(xì)胞中的表達(dá)③重組S100A4在胃癌細(xì)胞MKN1中的表達(dá)(RT-PCR)②pcDNA3.1-S100A4真核表達(dá)載體構(gòu)建①構(gòu)建S100A4編碼區(qū)克隆載體（一）構(gòu)建S100A4編碼區(qū)克隆載體：

1.提取胃粘膜上皮細(xì)胞GES-1總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，PCR擴(kuò)增S100A4編碼區(qū)序列；擴(kuò)增片段長度327bp。所用引物序列如下：5'-CCCAAGCTTGTCATGGCGTGCCCT-3'；5'-CGCGGATCCTCATTTCTTCCTGGGCT-3'PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)，應(yīng)用膠回收試劑盒回收、純化目的片段。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1實(shí)驗(yàn)方法2.構(gòu)建pMD18-Tsimple-S100A4克隆載體；

PCR產(chǎn)物連接入pMD18-Tsimple載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞提取質(zhì)?？寺‘a(chǎn)物的PCR、酶切、測序鑒定

實(shí)驗(yàn)結(jié)果2實(shí)驗(yàn)方法

(二)pcDNA3.1-S100A4真核表達(dá)載體構(gòu)建：

重組質(zhì)粒pMD18-Tsimple-S100A4以BamHI/HindⅢ雙酶切，與經(jīng)BamHI/HindⅢ雙酶切的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)連接，轉(zhuǎn)化，篩選重組克隆并提取質(zhì)粒，酶切鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果3實(shí)驗(yàn)方法（三）重組S100A4在胃癌細(xì)胞MKN1中的表達(dá)：

1.應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。在胃癌細(xì)胞系MKN1中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-S100A4表達(dá)載體，以轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體和正常未轉(zhuǎn)染的MKN1細(xì)胞作為對照。2.RT-PCR方法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)S100A4mRNA表達(dá)。相關(guān)引物序列：實(shí)驗(yàn)結(jié)果4實(shí)驗(yàn)方法引物序列

S100A4F5’-GATGTGATGGTGTCCACCTT-3’R5’-ATTTCTTCCTGGGCTGCTTA-3’

β-actinF5’-CTCTTCCAgCCTTCCTTCCT-3’R5’-CACCTTCACCgTTCCAgTTT-3’實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)RT-PCR進(jìn)行S100A4基因片段的擴(kuò)增將RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳可見預(yù)期的327bp大小的基因片段，

圖1S100A4基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果：M:DL2000marker;1.RT-PCR擴(kuò)增S100A4基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果（2）S100A4基因的序列測定

PCR產(chǎn)物連接克隆載體測序結(jié)果顯示與GeneBank公布序列一致，無突變（見圖2）實(shí)驗(yàn)結(jié)果（3）pcDNA3.1-S100A4表達(dá)載體的構(gòu)建

構(gòu)建的pcDNA3.1-S100A4載體經(jīng)HindⅢ/BamHI雙酶切鑒定結(jié)果見圖3。由結(jié)果可以確定真核表達(dá)載體pcDNA3.1-S100A4構(gòu)建成功。圖3pcDNA3.1-S100A4載體雙酶切。M:DL2000marker;1.pcDNA3.1-S100A4;2.pcDNA3.1-S100A4載體雙酶切結(jié)果；實(shí)驗(yàn)結(jié)果（4）pcDNA3.1-S100A4表達(dá)載體的鑒定

在胃癌細(xì)胞系MKN1中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-S100A4表達(dá)載體，以轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體和正常未轉(zhuǎn)染的MKN1細(xì)胞作為對照。結(jié)果表明轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-S100A4表達(dá)載體48小時(shí)后，S100A4mRNA表達(dá)水平明顯升高（如圖4）。圖4，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-S100A4

表達(dá)載體后S100A4的表達(dá)。M:DL2000marker;1：未轉(zhuǎn)染的正常MKN1細(xì)胞；2:轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-empty陰性對照；3：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-S100A4前言實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果討論參考文獻(xiàn)討論S100A4與腫瘤：

S100A4蛋白是S100蛋白家族的成員之一，許多研究表明S100A4在多種腫瘤表達(dá)高于癌旁組織，如：乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、甲狀腺癌等，并且與腫瘤不良預(yù)后相關(guān)。討論S100A4參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)，其在腫瘤中作用的分子機(jī)制是目前研究的熱點(diǎn)。由此我們推測：如能通過實(shí)驗(yàn)性過表達(dá)的方法改變S100A4表達(dá)，檢測其對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，將有助于進(jìn)一步證實(shí)S100A4在腫瘤中的作用。討論

pcDNA3.1-S100A4真核表達(dá)載體的構(gòu)建：本實(shí)驗(yàn)利用RT-PCR及基因重組技術(shù)，成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDNA3.1-S100A4。它的構(gòu)建有助于我們通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染手段，將S100A4導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，讓S100A4在胃癌細(xì)胞中高度表達(dá)，為進(jìn)一步研究S100A4對胃癌的增殖，侵襲及凋亡等生物學(xué)特性的影響提供良好的基礎(chǔ)。重組S100A4在胃癌細(xì)胞MKN1中的表達(dá)應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。在胃癌細(xì)胞系MKN1中轉(zhuǎn)染cDNA3.1-S100A4表達(dá)載體（以轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體和正常未轉(zhuǎn)染的MKN1細(xì)胞作為對照）。結(jié)果表明轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-S100A4表達(dá)載體48小時(shí)后，S100A4mRNA表達(dá)水平顯著升高，說明構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)并成功表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)為研究S100A4

在胃癌發(fā)病中的作用以及進(jìn)一步探索S100A4

基因是否作為胃癌診治的靶標(biāo)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。討論參考文獻(xiàn)[1]FengG,XuX,YoussefEM.DiminishedexpressionofS100A2,aputativetumorsuppressor,atearlystageofS100A2humanlungcarcinogenesis.CancerRes,2001,61:7999-8004.[2]LuoX,SharffKA,ChenJ，etal.S100A6expressionandfunctioninhumana.ClinOrthopRelatRes,2008,466:2060-2070.[3]DonatoR.SLOO.Amuitigenicfamilyofcalcium-modulatedproteinsofEF-handtypewithintracellularandextra-cellularfunctionalroles.TntJBiochemCellBiol,2001,33:637668.[4]姬俊芳.S100蛋白家族與腫瘤.國外醫(yī)學(xué)(腫瘤學(xué)分期),2002,29:261-263.[5]IngoM,ArminV,AndreasZ,etal.GeneticAnalysisoftheEpidermalDifferentiationComplex(EDC)onHumanChromosome1q21:ChromosomalOrientation,NewMarkers,anda6-MBYACContig.Genomics,1996,37:295-302.[6]SherbetGV,LakshmMS.S100A4(MTSI)calciumbindingproteinincancergrowth,invasionandmetastasis.AnticancerRes,1998,8:2415-2421參考文獻(xiàn)[7]IsmailNI,KaurG,HashimH,etal.S100A4overexpressionprovestobeindependentmarkerforbreastcancerprogression.CancerCellInt,2008,8:2867-2889.[8]RostyC,UekiT,ArganiP,etal.OverexpressionofS100A4inpancreaticductaladenocarcinomasisassociatedwithpoordifferentiationandDNAhypomethylation.AmJPathol,2002,160:45-50.[9]YonemuraY,EndouY,KimuraK,etal.InverseexpressionofS100A4andE-cadherinisassociatedwithmetastaticpotentialingastriccancer.ClinCancerRes,2000,6:4234-4242.[10]ItoY,YoshidaH,TomodaC,etal.S100A4expressionisanearlyeventofpapillarycarcinomaofthethyroid.Oncology,2004,67:397-402.[11]PedersenKB,AndersenK,FodstadO,etal.Sensitizationofinterferon-gammainducedapoptosisinhumanacellsbyextracellularS100A4.BMCCancer,2004,19;4:52.[12]GaoXN,TangSQ,ZhangXF,etal.S100A4antisenseoligodeoxynucleotidesuppressesinvasivepotentialofneuroblastomacells.JPediatrSurg,2005,40:648-652.[13]HuaJ,ChenD,FuH,etal.ShorthairpinRNA-mediatedinhibitionofS100A4PromotesapoptosisandsuppressesproliferationofBGC823gastr