§1-1DNA重組技術(shù)的根本(gēnběn)工具和根本(gēnběn)操作程序?qū)ｎ}(zhuāntí)1基因工程第一頁(yè)，共64頁(yè)。1一基因工程(jīyīngōngchéng)的根本內(nèi)容主要(zhǔyào)內(nèi)容〔一〕基因工程(jīyīngōngchéng)的概念〔二〕基因工程(jīyīngōngchéng)的根本工具〔三〕基因工程(jīyīngōngchéng)的根本操作程序〔四〕基因工程(jīyīngōngchéng)的應(yīng)用第二頁(yè)，共64頁(yè)。2基因工程(jīyīngōngchéng)的概念基因工程又叫基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)。該技術(shù)是在生物(shēngwù)體外，通過(guò)對(duì)DNA分子進(jìn)行人工“剪切〞和“拼接〞，對(duì)生物(shēngwù)的基因進(jìn)行改造和重新組合，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行無(wú)性繁殖，使重組基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生出人類(lèi)所需要的基因產(chǎn)物。復(fù)習(xí)(fùxí)第三頁(yè)，共64頁(yè)。3基因工程的別名操作環(huán)境操作對(duì)象操作水平基本過(guò)程結(jié)果基因拼接技術(shù)(jìshù)或DNA重組技術(shù)(jìshù)生物體外基因(jīyīn)DNA分子(fēnzǐ)水平人類(lèi)需要的基因產(chǎn)物剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)實(shí)質(zhì)基因重組復(fù)習(xí)第四頁(yè)，共64頁(yè)。4基因工程培育抗蟲(chóng)棉的簡(jiǎn)要(jiǎnyào)過(guò)程：普通(pǔtōng)棉花(無(wú)抗蟲(chóng)特性)蘇云金芽孢(yábāo)桿菌提取抗蟲(chóng)基因與運(yùn)載體DNA拼接導(dǎo)入棉花細(xì)胞(含抗蟲(chóng)基因)棉花植株(有抗蟲(chóng)特性)復(fù)習(xí)第五頁(yè)，共64頁(yè)。5基因工程(jīyīngōngchéng)的關(guān)鍵步驟：關(guān)鍵步驟一：抗蟲(chóng)基因(jīyīn)從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來(lái)關(guān)鍵步驟二：抗蟲(chóng)基因與運(yùn)載(yùnzài)體DNA連接關(guān)鍵步驟三：抗蟲(chóng)基因?qū)胧荏w(棉花)細(xì)胞復(fù)習(xí)第六頁(yè)，共64頁(yè)。6解決基因工程關(guān)鍵步驟需要(xūyào)的工具關(guān)鍵步驟一的工具(gōngjù)：關(guān)鍵步驟二的工具(gōngjù)：關(guān)鍵步驟三的工具(gōngjù)：限制性?xún)?nèi)切酶DNA連接酶運(yùn)載(yùnzài)體復(fù)習(xí)第七頁(yè)，共64頁(yè)。7第八頁(yè)，共64頁(yè)。8基因的剪刀(jiǎndāo)——限制性?xún)?nèi)切酶〔簡(jiǎn)稱(chēng)限制酶〕限制(xiànzhì)酶是在生物體(主要是微生物)內(nèi)的一種酶，能將外來(lái)的DNA切斷，由于這種切割作用是在DNA分子內(nèi)部進(jìn)行的，故名限制(xiànzhì)性?xún)?nèi)切酶。特點(diǎn)：特異性。即一種限制(xiànzhì)酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列，并且能在特定的切點(diǎn)上切割DNA分子。復(fù)習(xí)(fùxí)第九頁(yè)，共64頁(yè)。9識(shí)別(shíbié)序列大多數(shù)限制酶的識(shí)別(shíbié)序列由6個(gè)核苷酸組成。也有少數(shù)限制酶識(shí)別(shíbié)序列由4、5、或8個(gè)核苷酸組成。迄今為止，有300多種微生物中別離(biélí)出4000種限制酶第十頁(yè)，共64頁(yè)。10大腸桿菌(dàchánɡɡǎnjūn)(E.coli)的一種限制酶能識(shí)別GAATTC序列，并在G和A之間切開(kāi)。限制(xiànzhì)酶第十一頁(yè)，共64頁(yè)。11限制(xiànzhì)酶第十二頁(yè)，共64頁(yè)。12被限制酶切開(kāi)的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)(jǐɡè)伸出的核苷酸，他們之間正好互補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口叫黏性末端。第十三頁(yè)，共64頁(yè)。13平末端(mòduān)第十四頁(yè)，共64頁(yè)。14要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口(qiēkǒu)？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性末端？提問(wèn)(tíwèn)要切兩個(gè)切口，產(chǎn)生(chǎnshēng)四個(gè)黏性末端。如果把兩種來(lái)源不同的DNA用同一種限制酶來(lái)切割，會(huì)怎樣呢？會(huì)產(chǎn)生相同的黏性末端，然后讓兩者的黏性末端黏合起來(lái)，就似乎可以合成重組的DNA分子了。第十五頁(yè)，共64頁(yè)。152、基因(jīyīn)的針線——DNA連接酶DNA連接酶可把黏性末端之間的縫隙“縫合〞起來(lái)，即把梯子兩邊(liǎngbiān)扶手的斷口連接起來(lái)，這樣一個(gè)重組的DNA分子就形成了。第十六頁(yè)，共64頁(yè)。16從大腸桿菌中別離得到(dédào)的。只能用于粘性末端的連接T4DNA連接酶從T4噬菌體中別離得到的。既能用于粘性末端(mòduān)的連接，又能用于平末端(mòduān)的連接，但是平末端(mòduān)的連接效率低。第十七頁(yè)，共64頁(yè)。17為什么要用運(yùn)載(yùnzài)體？1、直接將目的基因連接到受體細(xì)胞的DNA上不能表達(dá)。2、只有利用某種能夠侵染受體細(xì)胞，并且(bìngqiě)在受體細(xì)胞中能夠復(fù)制和表達(dá)的載體來(lái)用于表達(dá)。第十八頁(yè)，共64頁(yè)。18作為運(yùn)載(yùnzài)體必須具備哪些條件1〕能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存。2〕具多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接(liánjiē)。3〕具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選。如抗菌素的抗性基因、產(chǎn)物具有顏色反響的基因等。第十九頁(yè)，共64頁(yè)。19常用的運(yùn)載(yùnzài)體主要有兩類(lèi)：1〕細(xì)菌(xìjūn)細(xì)胞質(zhì)的質(zhì)粒2〕噬菌體或某些動(dòng)植物病毒第二十頁(yè)，共64頁(yè)。20質(zhì)粒：質(zhì)粒是染色體外能夠(nénggòu)進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單位，包括真核生物的細(xì)胞器和細(xì)菌細(xì)胞中核區(qū)外的DNA分子?，F(xiàn)在習(xí)慣上用來(lái)專(zhuān)指細(xì)菌、酵母菌和放線菌等生物中核以外的DNA分子。質(zhì)粒是基因工程最常用的運(yùn)載體。絕大多數(shù)細(xì)菌質(zhì)粒都是閉合環(huán)狀DNA分子。有的一個(gè)細(xì)菌中有一個(gè)，有的一個(gè)細(xì)菌中有多個(gè)。第二十一頁(yè)，共64頁(yè)。21大腸桿菌(dàchánɡɡǎnjūn)的質(zhì)粒：最常用的質(zhì)粒是大腸桿菌(dàchánɡɡǎnjūn)的質(zhì)粒，其中常含有抗藥基因，如四環(huán)素的標(biāo)記基因。質(zhì)粒的存在與否對(duì)宿主細(xì)胞生存沒(méi)有決定性作用，但復(fù)制只能在宿主細(xì)胞內(nèi)成。第二十二頁(yè)，共64頁(yè)。22原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)(jiégòu)(補(bǔ)充內(nèi)容〕非編碼(biānmǎ)區(qū)非編碼(biānmǎ)區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子終止子①不編碼蛋白質(zhì)。：編碼蛋白質(zhì),連續(xù)不間斷編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)②調(diào)控遺傳信息表達(dá),上游有啟動(dòng)子，下游有終止子第二十三頁(yè)，共64頁(yè)。23真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)(jiégòu)〔補(bǔ)充內(nèi)容〕編碼(biānmǎ)區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合(jiéhé)位點(diǎn)內(nèi)含子外顯子啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用,上游有啟動(dòng)子，下游有終止子非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子第二十四頁(yè)，共64頁(yè)。24原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點(diǎn)都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因(jīyīn)結(jié)構(gòu)比較連續(xù)(liánxù)不連續(xù)(liánxù)編碼區(qū)非編碼第二十五頁(yè)，共64頁(yè)。25四個(gè)根本(gēnběn)步驟：三、基因工程(jīyīngōngchéng)的根本操作程序1〕提取(tíqǔ)目的基因2〕目的基因與運(yùn)載體結(jié)合3〕將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4〕目的基因的檢測(cè)和表達(dá)第二十六頁(yè)，共64頁(yè)。26目的(mùdì)基因目的基因是人們所需要轉(zhuǎn)移(zhuǎnyí)或改造的基因。如蘇云金芽孢(yábāo)桿菌的抗蟲(chóng)基因，還有植物的抗病〔抗病毒、抗細(xì)菌〕基因、種子貯藏蛋白的基因，以及人的胰島素基因、干擾素基因等。供體生物細(xì)胞取出DNA用限制酶剪去多余部分目的基因限制酶第二十七頁(yè)，共64頁(yè)。271、目的基因(jīyīn)的獲取1〉目的(mùdì)基因主要是指______________________編碼(biānmǎ)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因請(qǐng)舉出三個(gè)以上的例子2〉獲取目的基因的常用方法〔1〕從基因文庫(kù)中獲取〔2〕利用PCR技術(shù)擴(kuò)增〔3〕人工合成第二十八頁(yè)，共64頁(yè)。28概念(gàiniàn)：基因文庫(kù)〔genelibrary〕基因組文庫(kù)部分基因文庫(kù)（如cDNA文庫(kù)）將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存(chǔcún),各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱(chēng)為基因文庫(kù)(genelibrary)第二十九頁(yè)，共64頁(yè)。29基因組文庫(kù):基因文庫(kù)中包含了一種生物(shēngwù)所有的基因,這種基因文庫(kù)叫做基因組文庫(kù).局部基因文庫(kù):基因文庫(kù)中包含了一種生物(shēngwù)的一局部基因,這種基因文庫(kù)叫做局部基因文庫(kù).第三十頁(yè)，共64頁(yè)。30基因組文庫(kù)(wénkù)與局部基因文庫(kù)(wénkù)的關(guān)系第三十一頁(yè)，共64頁(yè)。31cDNA文庫(kù)(wénkù)的構(gòu)建mRNA反轉(zhuǎn)錄cDNA(互補(bǔ)DNA）DNA聚合酶雙鏈DNA②反轉(zhuǎn)錄(zhuǎnlù)法：基因重組反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA第三十二頁(yè)，共64頁(yè)。32基因組DNA文庫(kù)(wénkù)cDNA文庫(kù)(wénkù)基因組DNA文庫(kù)(wénkù)與cDNA文庫(kù)(wénkù)的比較第三十三頁(yè)，共64頁(yè)。33如何從基因文庫(kù)中得到所需要(xūyào)的基因？依據(jù)(yījù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因的功能(gōngnéng)基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。第三十四頁(yè)，共64頁(yè)。34④利用(lìyòng)PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因PCR——聚合酶鏈?zhǔn)椒错懯且豁?xiàng)生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸(hésuān)合成技術(shù)。通過(guò)此技術(shù)，可獲取大量的目的基因。第三十五頁(yè)，共64頁(yè)。35DNA序列(xùliè)自動(dòng)測(cè)序儀：PCR技術(shù)：對(duì)提取出來(lái)(chūlái)的基因進(jìn)行核苷酸序列分析。使目的基因(jīyīn)的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬(wàn)倍地?cái)U(kuò)增。第三十六頁(yè)，共64頁(yè)。36⑤人工合成(rénɡōnɡhéchénɡ)——根據(jù)的氨基酸序列(xùliè)合成DNA蛋白質(zhì)的氨基酸序列(xùliè)mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測(cè)推測(cè)目的基因化學(xué)合成第三十七頁(yè)，共64頁(yè)。373、基因表達(dá)載體(zàitǐ)〔重組質(zhì)?！车臉?gòu)建〔1〕用一定(yīdìng)的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出____________。〔2〕用___________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________。〔3〕將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再參加(cānjiā)適量___________，形成了一個(gè)重組DNA分子〔重組質(zhì)?！诚拗泼葛ば阅┒送环N限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同1〉過(guò)程:第三十八頁(yè)，共64頁(yè)。382〉基因表達(dá)載體(zàitǐ)的組成：它們有什么(shénme)作用？a、目的(mùdì)基因b、啟動(dòng)子c、終止子d、標(biāo)記基因位于基因的首端,是mRNA結(jié)合位點(diǎn)位于基因的末端,終止轉(zhuǎn)錄檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞條件第三十九頁(yè)，共64頁(yè)。39步驟二：目的基因與運(yùn)載(yùnzài)體重組1〕用一定的限制酶切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出黏性末端。2〕用同一種限制酶切斷目的(mùdì)基因，使其產(chǎn)生相同的黏性末端。3〕將切下的目的(mùdì)基因片段插入質(zhì)粒的切口處，再參加適量DNA連接酶，形成了一個(gè)重組DNA分子〔重組質(zhì)?！衬康幕蚺c運(yùn)載體的結(jié)合過(guò)程(guòchéng)，實(shí)際上是不同來(lái)源的基因重組的過(guò)程(guòchéng)。第四十頁(yè)，共64頁(yè)。40質(zhì)粒目的(mùdì)基因限制(xiànzhì)酶處理一個(gè)切口兩個(gè)(liǎnɡɡè)黏性末端兩個(gè)切口獲得目的基因DNA連接酶表達(dá)載體同一種過(guò)程:第四十一頁(yè)，共64頁(yè)。412、基因表達(dá)載體的作用a、使目的(mùdì)基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并遺傳給子代b、同時(shí)使目的基因(jīyīn)能表達(dá)和發(fā)揮作用思考：作為基因工程表達(dá)載體，只需含有目的基因就可以完成(wánchéng)任務(wù)嗎？為什么？第四十二頁(yè)，共64頁(yè)。42目的(mùdì)基因與運(yùn)載體結(jié)合第四十三頁(yè)，共64頁(yè)。43常用(chánɡyònɡ)的受體細(xì)胞：有大腸桿菌(dàchánɡɡǎnjūn)、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。將目的基因(jīyīn)導(dǎo)入受體細(xì)胞的原理借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。步驟三：目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞第四十四頁(yè)，共64頁(yè)。441〕將細(xì)菌用CaCl2處理，以增大細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性。2〕使含有目的基因的重組質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞。3〕目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)，隨其繁殖(fánzhí)而復(fù)制，由于細(xì)菌繁殖(fánzhí)的速度非?？?，在很短的時(shí)間內(nèi)就能獲得大量的目的基因。第四十五頁(yè)，共64頁(yè)。451、將目的基因(jīyīn)導(dǎo)入植物細(xì)胞〔1〕農(nóng)桿菌(gǎnjūn)轉(zhuǎn)化法特點(diǎn)(tèdiǎn):能感染雙子葉植物和祼子植物,對(duì)單子葉植物無(wú)感染能力Ti質(zhì)粒的T—DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞并整合到其染色體上轉(zhuǎn)化過(guò)程:Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞插入植物細(xì)胞染色DNA表達(dá)新性狀轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌第四十六頁(yè)，共64頁(yè)。46〔2〕基因(jīyīn)槍法基因槍法又稱(chēng)微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)力，將包裹在金屬顆粒外表的表達(dá)載體(zàitǐ)DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。第四十七頁(yè)，共64頁(yè)。47〔3〕花粉(huāfěn)通道法植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過(guò)花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆螅ǚ坌纬?xíngchéng)的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA〔含目的基因〕，使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞。第四十八頁(yè)，共64頁(yè)。482、將目的(mùdì)基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞方法(fāngfǎ):顯微(xiǎnwēi)注射技術(shù)操作程序:提純含目的基因表達(dá)載體取受精卵顯微注射移植到子宮受精卵發(fā)育新性狀動(dòng)物第四十九頁(yè)，共64頁(yè)。493、將目的(mùdì)基因?qū)胛⑸锛?xì)胞常用(chánɡyònɡ)法：Ca2+處理常用(chánɡyònɡ)菌：大腸桿菌微生物作受體細(xì)胞原因：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少過(guò)程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA第五十頁(yè)，共64頁(yè)。50步驟四：目的基因(jīyīn)的檢測(cè)和表達(dá)四環(huán)素抗性基因氨芐青霉素抗性基因第五十一頁(yè)，共64頁(yè)。51(四)目的基因的檢測(cè)(jiǎncè)與鑒定檢測(cè)(jiǎncè)①導(dǎo)入檢測(cè)(jiǎncè)：目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞方法——DNA分子雜交②表達(dá)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄檢測(cè)——分子雜交翻譯檢測(cè)——抗原抗體雜交分子檢測(cè)法鑒定抗蟲(chóng)鑒定抗病鑒定活性鑒定等個(gè)體水平的鑒定第五十二頁(yè)，共64頁(yè)。52不能，受體細(xì)胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，才能說(shuō)明(shuōmíng)目的基因完成了表達(dá)。受體細(xì)胞攝入DNA分子后就說(shuō)明(shuōmíng)目的基因完成了表達(dá)嗎？假設(shè)不能表達(dá)，要對(duì)抗(duìkàng)蟲(chóng)基因再進(jìn)行修飾。第五十三頁(yè)，共64頁(yè)。53知識(shí)延伸——DNA分子雜交(zájiāo)技術(shù)該方法是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原那么，把互補(bǔ)的雙鏈DNA解開(kāi)，把單股的DNA小片段用同位素、熒光分子(fēnzǐ)或化學(xué)發(fā)光催化劑等進(jìn)行標(biāo)記，之后同被檢測(cè)的DNA中的同源互補(bǔ)序列雜交，從而檢出所要查明的DNA或基因。第五十四頁(yè)，共64頁(yè)。54返回第五十五頁(yè)，共64頁(yè)。55DNA附著(fùzhuó)在膜上硝化(xiāohuà)纖維素加探針(tànzhēn)報(bào)告基因〔含熒光素分子〕變性DNA雜交〔如檢測(cè)SARS病毒等〕abcd第五十六頁(yè)，共64頁(yè)。56復(fù)習(xí)題1〕將目的(mùdì)基因?qū)胧荏w細(xì)胞有哪些方法?(試舉例說(shuō)明)2〕簡(jiǎn)述(jiǎnshù)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法第五十七頁(yè)，共64頁(yè)。57非編碼(biānmǎ)區(qū)非編碼(biānmǎ)區(qū)編碼(biānmǎ)區(qū)RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)外顯子內(nèi)含子終止子基因的結(jié)構(gòu)啟動(dòng)子原核真核第五十八頁(yè)，共64頁(yè)。581〕以下說(shuō)法正確的選項(xiàng)是〔〕A、所有的限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體C、運(yùn)載體必須具備的