第1節(jié)傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)的應(yīng)用一、發(fā)酵與傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)1.發(fā)酵：指人們利用微生物，在適宜的條件下，將原料通過微生物的代謝轉(zhuǎn)化為人類所需要的產(chǎn)物的過程。2.傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)：直接利用原材料中天然存在的微生物，或利用前一次發(fā)酵保存下來的面團(tuán)、鹵汁等發(fā)酵物中的微生物進(jìn)行發(fā)酵、制作食品的技術(shù)一般稱為傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)。以混合菌種的固體發(fā)酵及半固體發(fā)酵為主。常見食品：醬、醬油、醋、泡菜、豆豉等。二、腐乳、泡菜、果酒和果醋的制作原理1.腐乳的制作（1）菌種：酵母、曲霉、毛霉等，起主要作用的是毛霉。（2）發(fā)酵原理：豆腐中的蛋白質(zhì)經(jīng)毛霉等微生物發(fā)酵分解成小分子的肽和氨基酸。2.泡菜的制作（1）菌種：乳酸菌eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(分布：廣泛分布在空氣、土壤、植物體表、人或動(dòng)物的,腸道內(nèi)等,代謝類型：異養(yǎng)厭氧型,常見種類：乳酸鏈球菌和乳酸桿菌,利用：可用于乳制品的發(fā)酵、泡菜的腌制等))發(fā)酵原理：乳酸菌在無氧的情況下，將葡萄糖分解成乳酸（3）反應(yīng)式：C6H12O6eq\o(→,\s\up7(酶))2C3H6O3(乳酸)＋能量果酒的制作（1）菌種：酵母菌eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(分布：含糖量較高的水果、蔬菜表面等,代謝類型：異養(yǎng)兼性厭氧型,最適生長(zhǎng)溫度：約為28℃釀酒酵母,利用：可用于釀酒、制作饅頭和面包等))發(fā)酵原理：酵母菌在無氧條件下，進(jìn)行酒精發(fā)酵，產(chǎn)生酒精反應(yīng)式：C6H12O6eq\o(→,\s\up7(酶))2C2H5OH(酒精)＋2CO2＋能量果醋的制作（1）菌種：醋酸菌eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(代謝類型：異養(yǎng)需氧型,最適生長(zhǎng)溫度：30～35℃,利用：可用于制作各種風(fēng)味的\a\vs4\al(醋)))（2）發(fā)酵原理①當(dāng)O2、糖源都充足時(shí)，醋酸菌能將糖分解成乙酸反應(yīng)式：C6H12O6＋2O2eq\o(→,\s\up7(酶))2CH3COOH(乙酸)＋2H2O＋2CO2＋能量②當(dāng)缺少糖源時(shí)，醋酸菌則將乙醇轉(zhuǎn)化為乙醛，再將乙醛變?yōu)橐宜岱磻?yīng)式：C2H5OH＋O2eq\o(→,\s\up7(酶))CH3COOH(乙酸)＋H2O＋能量三、制作泡菜、果酒和果醋的實(shí)驗(yàn)流程1.制作泡菜的實(shí)驗(yàn)流程（1）將5%-20%鹽水煮沸、冷卻的目的是什么?煮沸：=1\*GB3①除去氧氣；=2\*GB3②殺滅鹽水中的其他微生物。冷卻：保證乳酸菌的生活環(huán)境。（2）為什么泡菜壇只能裝八成滿?①發(fā)酵初期，大腸桿菌、酵母菌會(huì)產(chǎn)生大量的二氧化碳，發(fā)酵液可能會(huì)溢出壇外。②過滿，鹽水不容易完全淹沒菜料，導(dǎo)致菜料腐爛。（3）鹽水沒過菜料、用水密封泡菜壇的目的是什么?創(chuàng)造無氧條件。（4）如果制作出的泡菜咸而不酸最可能的原因是什么?原因：食鹽濃度過高、發(fā)酵溫度過低等原因?qū)е聼o法正常發(fā)酵。（5）泡菜不宜多吃的原因?有些蔬菜含有硝酸鹽，放置過久后發(fā)生變質(zhì)會(huì)被還原成亞硝酸鹽，危害人體健康。（6）在制作泡菜前,可以向泡菜壇中加入一些陳泡菜水。目的是什么?目的：陳泡菜水中有純度較高的乳酸菌，相當(dāng)于接種乳酸菌。注意控制溫度、食鹽水濃度和發(fā)酵時(shí)間溫度過高、食鹽不足、腌制時(shí)間過短，會(huì)造成亞硝酸鹽含量升高。（一般亞硝酸鹽含量在泡菜腌制10d后開始下降）泡菜腌制中乳酸菌、乳酸和亞硝酸鹽的變化時(shí)期乳酸菌數(shù)量乳酸含量亞硝酸鹽含量初期少(O2抑制乳酸菌活動(dòng))少增加(硝酸鹽還原菌的作用)中期最多(乳酸積累抑制其他菌活動(dòng))增多下降(硝酸鹽還原菌受抑制，部分亞硝酸鹽被分解)后期減少(乳酸積累，pH下降，抑制自身活動(dòng))繼續(xù)增多(增長(zhǎng)減緩，最終不變)下降至相對(duì)穩(wěn)定(硝酸鹽還原菌被完全抑制)曲線制作果酒和果醋的實(shí)驗(yàn)流程（1）發(fā)酵裝置（2）葡萄是先沖洗還是先去梗?為什么?先沖洗再去枝梗；避免去枝梗引起葡萄破損增加被雜菌污染的機(jī)會(huì)。（3）葡萄能洗得太干凈嗎?不能，自然發(fā)酵利用附著在葡萄皮的野生酵母。（4）為什么裝瓶時(shí)要留有1/3的空間?=1\*GB3①酵母菌先有氧呼吸大量繁殖，耗盡氧氣后開始發(fā)酵；=2\*GB3②防止產(chǎn)生大量的二氧化碳造成發(fā)酵液溢出。（5）用簡(jiǎn)易裝置制作果酒適時(shí)擰松瓶蓋的目的是什么?能打開瓶蓋嗎?放出二氧化碳，防止炸瓶；不可以。葡萄酒一般呈深紅色的原因是什么?紅葡萄皮上的色素進(jìn)入發(fā)酵液。果酒制作與果醋制作的比較果酒制作果醋制作發(fā)酵菌種酵母菌醋酸菌菌種來源附著在葡萄皮上的野生型酵母菌空氣中的醋酸菌發(fā)酵產(chǎn)物酒精、二氧化碳乙酸、水或二氧化碳發(fā)酵條件溫度一般控制在18～30℃30～35℃時(shí)間10～12d7～8d氧氣初期需氧，后期不需氧始終需要氧pH果酒制作是否成功如何檢測(cè)?嗅味、品嘗、顯微鏡觀察酵母菌、用重鉻酸鉀的濃硫酸溶液（橙色變成灰綠色）果醋制作是否成功如何檢測(cè)?觀察菌膜、嗅味、品嘗、PH、顯微鏡觀察醋酸菌數(shù)量傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)中常用菌種的比較酵母菌醋酸菌乳酸菌分類真核生物原核生物原核生物代謝類型異養(yǎng)兼性厭氧異養(yǎng)需氧異養(yǎng)厭氧適宜溫度28℃30～35℃室溫發(fā)酵條件前期需氧；后期不需氧一直需氧無氧生殖方式適宜條件下出芽生殖；孢子生殖二分裂生殖二分裂生殖生產(chǎn)應(yīng)用釀酒、發(fā)面釀醋制作酸奶、泡菜第2節(jié)微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用一、培養(yǎng)基1.概念：人們按照微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。2.種類（按物理性質(zhì)分）液體培養(yǎng)基加入凝固劑（常用瓊脂）固體培養(yǎng)基。菌落：由單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞或少數(shù)同種細(xì)菌細(xì)胞，在適宜固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長(zhǎng)繁殖到一定程度，形成肉眼可見的子細(xì)胞群落（具有：形狀、大小、隆起程度、顏色等特征）。（2）微生物在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)可形成菌落營(yíng)養(yǎng)構(gòu)成：基本成分：水、碳源、氮源和無機(jī)鹽；特殊需求：pH、特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及O2的需求。例如：=1\*GB3①培養(yǎng)乳酸桿菌時(shí)，需要加入維生素；=2\*GB3②培養(yǎng)霉菌時(shí)，需要將培養(yǎng)基的pH調(diào)成酸性；=3\*GB3③培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)，需要將培養(yǎng)基的pH調(diào)成中性或弱堿性；=4\*GB3④培養(yǎng)厭氧微生物時(shí)，需要提供無氧條件。二、無菌技術(shù)1.獲得純凈的微生物培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止雜菌污染。2.無菌技術(shù)主要包括：消毒、滅菌。消毒滅菌概念使用較為溫和的物理、化學(xué)或生物等方法殺死物體表面或內(nèi)部一部分微生物使用強(qiáng)烈的理化方法殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子適用對(duì)象操作空間、操作者的衣著和手等微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等常用方法煮沸消毒法：100℃煮沸5-6分鐘，用于日常生活用品的消毒；巴氏消毒法：62-65℃消毒30分鐘或80-90℃消毒30秒-1分鐘?；瘜W(xué)藥物消毒法：酒精擦拭雙手、氯氣排毒水源等。紫外線消毒法：用紫外線照射30分鐘，殺死表面或空氣中的微生物。濕熱滅菌：高壓蒸汽滅菌，在100kPa、121℃下維持15-30分鐘。干熱滅菌：在160-170℃，加熱2-3小時(shí)。耐高溫的和需保持干燥的物品適用。灼燒滅菌：在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒，適用于對(duì)接種工具、試管口或瓶口等容易污染的部位滅菌。三、微生物的純培養(yǎng)1.相關(guān)概念（1）培養(yǎng)物：在微生物學(xué)中，將接種于培養(yǎng)基內(nèi)，在合適條件下形成的含特定種類微生物的群體稱為培養(yǎng)物。（2）純培養(yǎng)物：由單一個(gè)體繁殖所獲得的微生物群體稱為純培養(yǎng)物。（3）純培養(yǎng)：獲得純培養(yǎng)物的過程就是純培養(yǎng)。2.酵母菌的純培養(yǎng)先滅菌，再倒平板。倒平板時(shí)，為什么要冷卻到50℃左右?①溫度過低，培養(yǎng)基會(huì)凝固；②溫度過高，燙手難以操作。錐形瓶瓶口要通過火焰,為什么?灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。倒平板時(shí)培養(yǎng)皿蓋能完全打開嗎?不能（應(yīng)該用左手的拇指和食指將培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙），防止雜菌污染。平板冷凝后為何要倒置?①防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基中；②避免培養(yǎng)基中的水分過快的揮發(fā)。不小心將培養(yǎng)基濺到皿蓋與皿底間的平板還能用嗎?不能，空氣中的微生物可能在皿蓋和皿底之間的培養(yǎng)基上滋生。如何檢驗(yàn)培養(yǎng)基是否徹底滅菌(平板是否合格)?將空白平板置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，若蕪雜菌生長(zhǎng)則為合格的培養(yǎng)基。微生物分離純化常用方法：平板劃線法、稀釋涂布平板法。3.平板劃線法（1）原理：通過接種環(huán)在固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。（2）灼燒接種環(huán)，待其冷卻后才能伸入菌液，以免溫度太高殺死菌種。（3）第二次及其以后的劃線操作，總是從上一次劃線末端開始，能使微生物的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐漸減少，最終得到由單個(gè)菌種繁殖而來的菌落。（4）劃線時(shí)最后一區(qū)不要與第一區(qū)相連。（5）劃線用力大小要適當(dāng)，防止用力過大將培養(yǎng)基劃破。（6）整個(gè)操作過程要在酒精燈火焰旁進(jìn)行，避免雜菌污染（7）在未接種的培養(yǎng)基表面是否有菌落生長(zhǎng)?如果有，說明了什么?沒有。如果有，說明培養(yǎng)基被雜菌污染。（8）在接種酵母菌的培養(yǎng)基上,如果觀察到了不同形態(tài)的菌落,可能是由哪些原因引起的?菌種不純或無菌操作不規(guī)范等。（9）操作第一步即取菌種之前，每次劃線之前，劃線操作結(jié)束時(shí)，都需要進(jìn)行火焰灼燒滅菌，每次灼燒的目的如下表：目的第一次操作殺死接種環(huán)上原有的微生物，避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物每次劃線前為了殺死上次劃線結(jié)束后接種環(huán)上殘留的菌種使下一次劃線的菌種直接來源于上次劃線的末端劃線結(jié)束殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者四、微生物的選擇培養(yǎng)和計(jì)數(shù)1.選擇培養(yǎng)基：在微生物學(xué)中，允許特定種類的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。（1）篩選分解尿素的細(xì)菌選用什么培養(yǎng)基?用尿素作為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基。，其他成分與普通培養(yǎng)基基本相同。（2）選擇培養(yǎng)基與鑒別培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基原理加入不影響/促進(jìn)目標(biāo)微生物生長(zhǎng)，而抑制/阻止其他種類微生物生長(zhǎng)的化學(xué)物質(zhì)加入某種指示劑或化學(xué)藥品，其能與微生物的某種代謝產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)用途培養(yǎng)、分離出目標(biāo)微生物鑒別目標(biāo)微生物舉例①在培養(yǎng)基中加入青霉素，分離酵母菌和霉菌；②以尿素為唯一氮源，培養(yǎng)可分解尿素的細(xì)菌。①用伊紅-美藍(lán)培養(yǎng)基，鑒定大腸桿菌(若有，出現(xiàn)帶金屬光澤的紫黑色菌落)；②用纖維素-剛果紅（紅色復(fù)合物）培養(yǎng)基，鑒別纖維素分解菌（若有，則出現(xiàn)透明圈）。2.間接計(jì)數(shù)——稀釋涂布平板法（1）原理：當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)單菌落，來源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌（通過菌落數(shù)，推測(cè)活菌數(shù)）。（2）注意事項(xiàng)：①一般選擇菌落數(shù)為30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)；②同一稀釋度下，至少對(duì)3個(gè)平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，求出平均值；③統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比實(shí)際活菌數(shù)偏?。ǘ鄠€(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到一個(gè)菌落）；④統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般用菌落數(shù)表示，而不是用活菌數(shù)來表示；⑤恰當(dāng)?shù)南♂尪?、涂布是否均勻，是成功統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的關(guān)鍵。計(jì)算公式：每克樣品中的活菌數(shù)=(C?V)×MC：某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)；V：涂布平板所用的稀釋液的體積；M：稀釋倍數(shù)。3.直接計(jì)數(shù)——顯微鏡直接計(jì)數(shù)法（細(xì)菌計(jì)數(shù)板/血細(xì)胞計(jì)數(shù)板）。（1）缺點(diǎn)：①不能區(qū)分死菌與活菌；②個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察。（2）每毫升原液所含細(xì)菌數(shù)：每小格內(nèi)平均細(xì)菌數(shù)×400×104×稀釋倍數(shù)（3）統(tǒng)計(jì)的活菌數(shù)往往比實(shí)際活菌數(shù)高偏高。4.土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)（1）原理：絕大多數(shù)微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基，可以從土壤中分離出分解尿素的細(xì)菌。（2）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)①土壤取樣：鏟去表層土，在距地表3～8cm的土壤層取樣。②樣品的稀釋：測(cè)定土壤中細(xì)菌的數(shù)量，一般選用1×104、1×105和1×106倍稀釋的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)。③微生物的培養(yǎng)與觀察：細(xì)菌一般在30～37℃的溫度下培養(yǎng)1～2d。每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果。（3）注意①第一次做實(shí)驗(yàn)時(shí)，稀釋倍數(shù)可以適當(dāng)放寬，選用1×103、1×104、1×105、1×106和1×107倍稀釋的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)；②樣品稀釋液的最佳濃度為獲得每個(gè)平板上最終有30～300個(gè)菌落；③每一稀釋倍數(shù)的菌液都至少要涂布3個(gè)平板，作為實(shí)驗(yàn)重復(fù)，求其平均值，（4）“微生物的選擇培養(yǎng)”的對(duì)照組目的：排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。常見對(duì)照組：①設(shè)置空白對(duì)照，用來檢驗(yàn)培養(yǎng)基滅菌是否合格②設(shè)置基本培養(yǎng)基，檢驗(yàn)選擇培養(yǎng)基是否有選擇作用。（5）結(jié)果分析現(xiàn)象結(jié)論有無雜菌污染的判斷對(duì)照的培養(yǎng)皿中無菌落生長(zhǎng)未被雜菌污染對(duì)照的培養(yǎng)皿中有菌落生長(zhǎng)被雜菌污染選擇培養(yǎng)基的篩選作用選擇培養(yǎng)基中菌落形態(tài)多樣培養(yǎng)基中混入其他氮源菌落數(shù)：基本培養(yǎng)基>選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基具有篩選作用菌落數(shù)：基本培養(yǎng)基≤選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基失去篩選作用樣品的稀釋得到2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30～300的平板實(shí)驗(yàn)成功第3節(jié)發(fā)酵工程及其應(yīng)用一、發(fā)酵工程1.概念：利用微生物的特定功能，通過現(xiàn)代工程技術(shù)，規(guī)?；a(chǎn)對(duì)人類有用的產(chǎn)品。3.選擇菌種時(shí)需要考慮哪些因素?①生產(chǎn)所需代謝物的產(chǎn)量高；②菌種穩(wěn)定，不易變異退化；③發(fā)酵條件易控制。4.怎樣對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行調(diào)控，以滿足微生物的生長(zhǎng)需要?①隨時(shí)檢測(cè)；②及時(shí)添加必要的營(yíng)養(yǎng)組分；③嚴(yán)格控制發(fā)酵條件。①?gòu)淖匀唤缰泻Y選；②誘變育種；③基因工程育種獲得。特點(diǎn)①