..細(xì)胞治療實(shí)驗(yàn)室工藝流程細(xì)胞治療實(shí)驗(yàn)室工藝流程按種類分為：一、試劑耗材入庫記錄,試劑耗材使用記錄,試劑配制記錄,配制的試劑使用記錄。入庫需要記錄產(chǎn)品的名稱、批號(hào)、有效期、數(shù)量、存放位置、入庫時(shí)間。試劑耗材使用記錄包括名稱、批號(hào)、用途,時(shí)間。試劑配制記錄包括原料的名稱、批號(hào),配制試劑的時(shí)間、有效期、批號(hào)。配制的試劑使用記錄包括使用的時(shí)間、批號(hào)、用途。二、實(shí)驗(yàn)記錄,包括采血、分血、細(xì)胞接種、補(bǔ)液、質(zhì)檢、回輸。采血有2個(gè)信息實(shí)驗(yàn)室需要記錄,包括濃縮白細(xì)胞體積和血漿體積。分血有需要記錄使用的分離液的量和單個(gè)核細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞接種需要記錄DC、CIK、CD3AK、γδT、NK等細(xì)胞接種數(shù)量、培養(yǎng)基體積、細(xì)胞因子添加的量。補(bǔ)液需要記錄補(bǔ)液的時(shí)間和體積。質(zhì)檢需要做細(xì)菌真菌培養(yǎng)、內(nèi)毒素檢測(cè)、革蘭氏檢測(cè),記錄做這些質(zhì)檢的時(shí)間?；剌斝枰涗浕剌?shù)募?xì)胞種類、時(shí)間、細(xì)胞體積、細(xì)胞數(shù)量。三、細(xì)胞檢測(cè)記錄,包括細(xì)菌真菌培養(yǎng),內(nèi)毒素檢測(cè),革蘭氏檢測(cè),流式檢測(cè)。記錄內(nèi)容包括樣品的來源、檢測(cè)時(shí)間、結(jié)果、檢測(cè)人。四、清洗消毒記錄。包括清洗消毒的時(shí)間、方式、消毒有效期。細(xì)胞培養(yǎng)流程圖采血采血分血DC細(xì)胞CIK細(xì)胞CD3AK細(xì)胞γδT細(xì)胞NK細(xì)胞其它細(xì)胞細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞接種2小時(shí)后洗版第5天加成熟劑1第6天加成熟劑2第7天收細(xì)胞,計(jì)算細(xì)胞存活率、細(xì)胞數(shù)后凍存或回輸?shù)?天加CIK混合因子根據(jù)細(xì)胞生長情況補(bǔ)液回輸前3天細(xì)菌真菌培養(yǎng)回輸前12小時(shí)革蘭氏染色計(jì)算細(xì)胞存活率、細(xì)胞數(shù)后給病人回輸根據(jù)細(xì)胞生長情況補(bǔ)液回輸前3天細(xì)菌真菌培養(yǎng)回輸前12小時(shí)革蘭氏染色根據(jù)細(xì)胞生長情況補(bǔ)液回輸前3天細(xì)菌真菌培養(yǎng)回輸前12小時(shí)革蘭氏染色根據(jù)細(xì)胞生長情況補(bǔ)液回輸前3天細(xì)菌真菌培養(yǎng)回輸前12小時(shí)革蘭氏染色計(jì)算細(xì)胞存活率、細(xì)胞數(shù)后給病人回輸計(jì)算細(xì)胞存活率、細(xì)胞數(shù)后給病人回輸計(jì)算細(xì)胞存活率、細(xì)胞數(shù)后給病人回輸NO：_自體細(xì)胞制劑制備記錄患者基本情況采血日期：姓名年齡性別科室病案號(hào)主管醫(yī)生床號(hào)傳染病臨床診斷病理切片細(xì)胞制備標(biāo)準(zhǔn)操作記錄分血數(shù)量單位日期操作人復(fù)核人備注自體血漿體積ml白細(xì)胞體積mlFicol體積ml批號(hào)：PBMC總量×109DC細(xì)胞制備數(shù)量單位日期操作人復(fù)核人備注1、PBMC用量×1082、鋪瓶〔板瓶〔板3、加DC培養(yǎng)液體積ml4、DC誘導(dǎo)因子〔100Xml批號(hào)：5、第五天加DC成熟劑1〔100Xml批號(hào)：6、第六天補(bǔ)加DC成熟劑2〔100Xml批號(hào)：7、第七〔八天收集DC×107CIK細(xì)胞制備數(shù)量單位日期操作人復(fù)核人備注1、添加IFN-rIU2、PBMC用量×1083、接種體積ml4、添加CIK混合因子〔100Xml批號(hào)：5、補(bǔ)液第1次ml第2次第3次第4次第5次第6次CD3AK細(xì)胞制備數(shù)量單位日期操作人復(fù)核人備注1、添加CD3AK混合因子〔100Xml批號(hào)：2、PBMC用量×1083、接種體積ml4、補(bǔ)液第1次ml第2次第3次第4次第5次γδT細(xì)胞制備數(shù)量單位日期操作人復(fù)核人備注1、PBMC用量×1092、接種體積ml3、添加γδT混合因子〔100Xml批號(hào)：4、補(bǔ)液第1次ml第2次第3次第4次第5次NK細(xì)胞制備數(shù)量單位日期操作人復(fù)核人備注1、PBMC用量×1082、接種體積ml3、添加NK細(xì)胞混合因子〔100Xml批號(hào)：4、補(bǔ)液第1次ml第2次第3次第4次第5次細(xì)胞凍存及復(fù)蘇標(biāo)準(zhǔn)操作記錄細(xì)胞凍存標(biāo)準(zhǔn)操作記錄日期編號(hào)細(xì)胞類型細(xì)胞數(shù)量凍存數(shù)量〔支凍存液編號(hào)存放位置操作人復(fù)核人備注細(xì)胞復(fù)蘇標(biāo)準(zhǔn)操作記錄日期編號(hào)細(xì)胞類型細(xì)胞數(shù)量復(fù)蘇數(shù)量〔支復(fù)蘇用途存放位置操作人復(fù)核人備注自體細(xì)胞制劑回輸記錄姓名年齡性別科室病案號(hào)床號(hào)次數(shù)日期細(xì)胞類型批號(hào)體積〔ml回輸方式運(yùn)送人接收人復(fù)核人123456789101112131415161718..自體細(xì)胞制劑檢控記錄次數(shù)細(xì)胞外觀細(xì)菌真菌培養(yǎng)革蘭氏染色細(xì)菌內(nèi)毒素最終檢定結(jié)果存活率數(shù)量操作人復(fù)核人回輸細(xì)胞批號(hào)均勻懸濁液,無異物第一次回輸前3天每次回輸當(dāng)天每次回輸當(dāng)天需經(jīng)檢定合格后方可回輸存活率≥85%1□是□否□陽性□陰性□陽性□陰性□陽性□陰性□合格□不合格2□是□否□陽性□陰性□陽性□陰性□陽性□陰性□合格□不合格3□是□否□陽性□陰性□陽性□陰性□陽性□陰性□合格□不合格4□是□否□陽性□陰性□陽性□陰性□陽性□陰性□合格□不合格5□是□否□陽性□陰性□陽性□陰性□陽性□陰性□合格□不合格6□是□否□陽性□陰性□陽性□陰性□陽性□陰性□合格□不合格7□是□否□陽性□陰性□陽性□陰性□陽性□陰性□合格□不合格8□是□否□陽性□陰性□陽性□陰性□陽性□陰性□合格□不合格9□是□否□陽性□陰性□陽性□陰性□陽性□陰性□合格□不合格10□是□否□陽性□陰性□陽性□陰性□陽性□陰性□合格□不合格11□是□否□陽性□陰性□陽性□陰性□陽性□陰性□合格□不合格12□是□否□陽性□陰性□陽性□陰性□陽性□陰性□合格□不合格13□是□否□陽性□陰性□陽性□陰性□陽性□陰性□合格□不合格..CIK細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作流程溶液的配置熱滅活自體血漿的制備：將自體血漿裝在無菌的離心管內(nèi),放入56攝氏度水浴鍋內(nèi)熱滅活40分鐘,取出用2500轉(zhuǎn)離心10分鐘,取出上清備用。IFN-r母液〔1000X：用無血清培養(yǎng)基配成100萬IU/ml。CIK混合因子<100X>：冰箱4度保存。CIK完全培養(yǎng)基：無血清培養(yǎng)基加1%-2%熱滅活自體血漿。CIK細(xì)胞制備：血細(xì)胞單采機(jī)采集病人濃縮白細(xì)胞和血漿〔80-100ml。準(zhǔn)備2支50ml離心管,每管加入淋巴細(xì)胞分離液20ml。將濃縮白細(xì)胞從血袋中取出,直接等量加到上述2支50ml離心管淋巴細(xì)胞分離液上面,2000轉(zhuǎn)離心25分鐘,升降速調(diào)到最低值。取出上層的血漿收集到一支50ml離心管中,余下的部分除紅細(xì)胞外全部收集到2支50ml離心管中,加生理鹽水到50ml,1500轉(zhuǎn)離心10分鐘,去除上清,合并2支管內(nèi)的細(xì)胞到一支50ml離心管中,加50ml生理鹽水,取20ul樣品用于計(jì)數(shù),1200轉(zhuǎn)離心7分鐘,去除上清。所有的血漿留出12支5ml用于回輸,其余全部56攝氏度滅活40分鐘,滅活完成后2500轉(zhuǎn)離心10分鐘,收集上清備用。將細(xì)胞用CIK完全培養(yǎng)基配成1X106/ml,加入IFN-r母液至1000IU/ml,接種1個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)袋,袋內(nèi)加200mlCIK完全培養(yǎng)基。24小時(shí)后,按1:100加入CIK混合因子。第5天,按4倍稀釋添加含300IU/mlIL-2的CIK完全培養(yǎng)基。第8天到第9天,按2倍稀釋添加含300IU/mlIL-2的CIK完全培養(yǎng)基。同時(shí)取樣做細(xì)菌真菌培養(yǎng)。以后每隔一天按2倍稀釋補(bǔ)一次液,第一次回輸前1天取樣送檢做革蘭氏染色檢查。等拿到細(xì)菌真菌培養(yǎng)結(jié)果后,檢查所有結(jié)果是否為陰性。CIK培養(yǎng)到第10天-15天內(nèi)回輸?；剌敃r(shí)收集細(xì)胞于離心管內(nèi),1200轉(zhuǎn)離心7分鐘,去除上清,收集細(xì)胞后加生理鹽水再離心2次,1200轉(zhuǎn)離心7分鐘。將收集到的細(xì)胞加入到150ml注射用生理鹽水中,加入5ml自體血漿,2萬IUIL-2,留1ml細(xì)胞懸液到1.5ml離心管中,4攝氏度存放3月備查。將完成的細(xì)胞懸液封好瓶口,核對(duì)病人姓名、性別、年齡、住院號(hào)、細(xì)胞數(shù)、無菌結(jié)果、病區(qū)及治療項(xiàng)目,確認(rèn)無誤后,貼上標(biāo)簽,送病區(qū)進(jìn)行回輸。DC細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作流程溶液的配置1、熱滅活自體血漿的制備：將自體血漿裝在無菌的離心管內(nèi),放入56攝氏度水浴鍋內(nèi)熱滅活40分鐘,取出用2500轉(zhuǎn)離心10分鐘,取出上清備用。2、DC基礎(chǔ)培養(yǎng)基：用無血清培養(yǎng)基+2%熱滅活自體血漿。3、DC誘導(dǎo)劑<100X：冰箱4度保存。4、DC培養(yǎng)基：DC基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入DC誘導(dǎo)劑4、DC成熟劑1<100X：冰箱4度保存。5、DC成熟劑2〔100X：冰箱4度保存。DC細(xì)胞制備：取PBMC,加入IMDM培養(yǎng)基配成5X106/ml細(xì)胞懸液,按每孔3ml接種到6孔板內(nèi),放入培養(yǎng)箱。2小時(shí)后,取出,晃動(dòng)去除上層雜細(xì)胞,留下貼壁的單核細(xì)胞〔體積比其它細(xì)胞稍大,每孔加入3mlDC培養(yǎng)基。第5天,按每孔30ul加入DC成熟劑1,取樣做細(xì)菌、真菌培養(yǎng)。收集細(xì)胞前12小時(shí)每孔加入30ulDC成熟劑2,同時(shí)取樣送檢做革蘭氏染色檢查。DC培養(yǎng)到第7-8天,收集細(xì)胞,用生理鹽水洗3次,分成4份,其中一份用于當(dāng)天回輸,其余凍存在-80度冰箱中。將生理鹽水清洗過的DC細(xì)胞加入到150ml注射用生理鹽水中,加入5ml自體血漿,留1ml細(xì)胞懸液到1.5ml離心管中,4攝氏度存放3月備查。將完成的細(xì)胞懸液封好瓶口,核對(duì)病人姓名、性別、年齡、住院號(hào)、細(xì)胞數(shù)、無菌結(jié)果、病區(qū)及治療項(xiàng)目,確認(rèn)無誤后,貼上標(biāo)簽,送病區(qū)進(jìn)行回輸。CD3AK細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作流程溶液的配置熱滅活自體血漿的制備：將自體血漿裝在無菌的離心管內(nèi),放入56攝氏度水浴鍋內(nèi)熱滅活40分鐘,取出用2500轉(zhuǎn)離心10分鐘,取出上清備用。CD3AK混合因子<100X：冰箱4度保存。CD3AK完全培養(yǎng)基：無血清培養(yǎng)基+1%-2%熱滅活自體血漿+CD3AK混合因子。CD3AK細(xì)胞制備：PBMC用CD3AK完全培養(yǎng)基配成1X106/ml,接種培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)袋培養(yǎng)。第5天,按4倍稀釋添加CD3AK完全培養(yǎng)基。第8天到第9天,按2倍稀釋添加CD3AK完全培養(yǎng)基。同時(shí)取樣做細(xì)菌真菌培養(yǎng)。以后每隔一天按2倍稀釋補(bǔ)一次液,第一次回輸前1天取樣送檢做革蘭氏染色檢查。等拿到細(xì)菌真菌培養(yǎng)結(jié)果后,檢查所有結(jié)果是否為陰性。CD3AK培養(yǎng)到第10天-15天內(nèi)回輸?；剌敃r(shí)收集細(xì)胞于離心管內(nèi),1200轉(zhuǎn)離心7分鐘,去除上清,收集細(xì)胞后加生理鹽水再離心2次,1200轉(zhuǎn)離心7分鐘。將收集到的細(xì)胞加入到150ml注射用生理鹽水中,加入5ml自體血漿,2萬IUIL-2,留1ml細(xì)胞懸液到1.5ml離心管中,4攝氏度存放3月備查。將完成的細(xì)胞懸液封好瓶口,核對(duì)病人姓名、性別、年齡、住院號(hào)、細(xì)胞數(shù)、無菌結(jié)果、病區(qū)及治療項(xiàng)目,確認(rèn)無誤后,貼上標(biāo)簽,送病區(qū)進(jìn)行回輸。γδT細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作流程溶液的配置熱滅活自體血漿的制備：將自體血漿裝在無菌的離心管內(nèi),放入56攝氏度水浴鍋內(nèi)熱滅活40分鐘,取出用2500轉(zhuǎn)離心10分鐘,取出上清備用。γδT混合因子<100X：冰箱4度保存。完全培養(yǎng)基：無血清培養(yǎng)基1%-2%熱滅活自體血漿。二、γδT細(xì)胞制備：將PBMC用完全培養(yǎng)基配成2X106/ml,加入混合因子,接種培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)袋培養(yǎng)。第5天,按2倍稀釋添加含400IU/mlIL-2的完全培養(yǎng)基。第8天到第9天,按2倍稀釋添加含400IU/mlIL-2的完全培養(yǎng)基。同時(shí)取樣做細(xì)菌真菌培養(yǎng)。以后每隔一天按2倍稀釋補(bǔ)一次液,第一次回輸前1天取樣送檢做革蘭氏染色檢查。等拿到細(xì)菌真菌培養(yǎng)結(jié)果后,檢查所有結(jié)果是否為陰性。γδT培養(yǎng)到第10天-15天內(nèi)回輸?；剌敃r(shí)收集細(xì)胞于離心管內(nèi),1200轉(zhuǎn)離心7分鐘,去除上清,收集細(xì)胞后加生理鹽水再離心2次,1200轉(zhuǎn)離心7分鐘。將收集到的細(xì)胞加入到150ml注射用生理鹽水中,加入5ml自體血漿,留1ml細(xì)胞懸液到1.5ml離心管中,4攝氏度存放3月備查。將完成的細(xì)胞懸液封好瓶口,核對(duì)病人姓名、性別、年齡、住院號(hào)、細(xì)胞數(shù)、無菌結(jié)果、病區(qū)及治療項(xiàng)目,確認(rèn)無誤后,貼上標(biāo)簽,送病區(qū)進(jìn)行回輸。NK細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作流程溶液的配置熱滅活自體血漿的制備：將自體血漿裝在無菌的離心管內(nèi),放入56攝氏度水浴鍋內(nèi)熱滅活40分鐘,取出用2500轉(zhuǎn)離心10分鐘,取出上清備用。NK細(xì)胞混合因子<100X：冰箱4度保存。完全培養(yǎng)基：SCGM無血清培養(yǎng)基+1%-2%熱滅活自體血漿。二、NK細(xì)胞制備：將PBMC用完全培養(yǎng)基配成1X106/ml,加入NK細(xì)胞混合因子,接種培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)袋培養(yǎng)。第5天,添加2倍量完全培養(yǎng)基,加入500IU/mlIL-2。第8天到第9天,按2倍稀釋添加含500IU/mlIL-2的完全培養(yǎng)基。同時(shí)取樣做細(xì)菌真菌培養(yǎng)。以后每隔一天按2倍稀釋補(bǔ)一次液,第一次回輸前1天取樣送檢做革蘭氏染色檢查。等拿到細(xì)菌真菌培養(yǎng)結(jié)果后,檢查所有結(jié)果是否為陰性。NK培養(yǎng)到第10天-15天內(nèi)回輸?；剌敃r(shí)收集細(xì)胞于離心管內(nèi),1200轉(zhuǎn)離心7分鐘,去除上清,收集細(xì)胞后加生理鹽水再離心2次,1200轉(zhuǎn)離心7分鐘。將收集到的細(xì)胞加入到150ml注射用生理鹽水中,加入5ml自體血漿,留1ml細(xì)胞懸液到1.5ml離心管中,4攝氏度存放3月備查。將完成的細(xì)胞懸液封好瓶口,核對(duì)病人姓名、性別、年齡、住院號(hào)、細(xì)胞數(shù)、無菌結(jié)果、病區(qū)及治療項(xiàng)目,確認(rèn)無誤后,貼上標(biāo)簽,送病區(qū)進(jìn)行回輸。細(xì)胞凍存和復(fù)蘇標(biāo)準(zhǔn)操作流程一、溶液的配置1、程序降溫盒的準(zhǔn)備：按程序降溫盒上的標(biāo)示量加入250ml異丙醇作為冷凍液,室溫放置。2、凍存液的配置：熱滅活自體血漿加入10%DMSO。細(xì)胞凍存1、將要凍存的細(xì)胞離心1200rpm,7min,去除舊的培養(yǎng)液。2、輕輕混勻細(xì)胞沉淀,加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液,DC細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度為5×106/ml～2×107/