病理檢驗技術

特殊染色結締組織和肌纖維

膠原纖維結締組織在廣義上包括多種組織成分,狹義上是指其含有的三種纖維,即膠原纖維、網(wǎng)狀纖維和彈性纖維。這三種纖維廣泛分布于身體各處,常見于器官與器官之間,組織與組織之間以及細胞與細胞之間。這些纖維具有支持連接、營養(yǎng)、防御保護和創(chuàng)傷修復等功能。這三種纖維在蘇木精-伊紅(HE)染色中有時難以區(qū)別,特別是在某些病理改變時。因此在病理診斷上常常要借助于特殊染色進行鑒別。

膠原纖維膠原纖維(

collagen

fiber)是三種纖維中分布最廣,含量最多的一種纖維。它廣泛分布于各臟器內(nèi)。在皮膚、鞏膜和肌腱最為豐富。膠原纖維具有韌性大、抗拉力強的特點。在弱酸或沸水中可慢慢溶化成膠水,稱為白明膠,所以這種纖維稱為膠原纖維。膠原纖維在新鮮時無色,粗細不等,直徑在1~12um之間,并有分支,互相交織成網(wǎng)。在電鏡下膠原纖維是由更細長的膠原原纖維集合成束而成。

已知膠原纖維又可分為十幾型,膠原分子呈棒狀,由三股同質(zhì)或異質(zhì)性螺旋形多肽鏈組成,其中Ⅰ型主要是骨、皮膚和肌腱膠原,Ⅱ型主要是軟骨膠原,Ⅲ型主要在胚胎組織以及成人血管、胃腸道,Ⅳ型只見于基膜等。通過用苦味酸-天狼星紅法在偏振光顯微鏡下可見Ⅰ型膠原纖維呈雙折射為橘黃色或亮紅色的粗纖維,Ⅲ型膠原纖維呈弱雙折射為綠色的細纖維,Ⅱ型膠原纖維在偏振光中不顯色。

膠原纖維染色在病理診斷上主要用于和肌纖維的鑒別。常用于顯示膠原纖維的方法有改良

VanGieson苦味酸麗春紅S法(簡稱改良V.G.法)、

Masson三色法和Mallory三色法等。所謂三色染色通常是指染胞核和能選擇性地顯示膠原纖維和肌纖維。其實V.G.法也是一種三色法,不過習慣上不稱三色法?？辔端猁惔杭tS法(V.G.法)

(改良

VanGieson)1.天青石藍染液

天青石藍B(celestin

blueB)0.5g

硫酸鐵銨(ferric

ammonium

sulphate)

5g

蒸餾水100ml

甘油(glycerin）14ml

麝香草酚(thymol)

50mg

取一只三角燒瓶盛蒸餾水,加入硫酸鐵銨,用玻璃棒攪動使其完全溶解。加入天青石藍B,繼續(xù)用玻璃棒攪勻,以文火煮沸2-3分鐘,在煮沸時應用玻璃棒不停輕輕攪動,否則天青石藍將沉積于瓶底成團塊狀。待冷卻后過濾于小口砂塞瓶,再加入甘油和麝香草酚,置4℃冰箱可保存1年以上。臨用前半小時由冰箱取出恢復至室溫。為方便操作可傾入一小滴瓶內(nèi)使用。2.

Mayer蘇木精染液

蘇木精(ematoxylin)0.1g

蒸餾水100ml

碘酸鈉(sodium

iodate)20mg

硫酸鋁銨(aluminum

ammonium

sulphate)5g

檸檬酸(citric

acid)0.1g

水合氯醛(chloral

hydrate)5g

取一只200ml潔凈三角燒瓶盛蒸餾水,加入蘇木精并輕輕搖動使完全溶解(可稍加溫至約50℃),再加入碘酸鈉及硫酸鋁銨,用玻璃棒輕輕攪動使硫酸鋁銨完全溶解,最后加入檸檬酸與水合氯醛,此時溶液呈淡紅紫色,過濾于小口砂塞瓶內(nèi)。保存和使用同天青石藍液。3.1%的鹽酸乙醇液70%的乙醇99ml

純鹽酸(

hydrochloric

acid)1ml

4.1%的麗春紅S(ponceau

S）

5.苦味酸(

picric

acid)飽和水溶液

取蒸餾水100ml,加入苦味酸約2g即成苦味酸飽和水溶液。

6.改良

VanGieson(改良V.G.)染液

甲液：1%的麗春紅S1ml

乙液：苦味酸飽和水溶液9ml

甲乙兩液臨用前按比例混合,混合液一次性使用,不能保存。

(二)染色步驟

1.組織固定于10%的甲醛液中,常規(guī)脫水包埋。

2.切片厚4um,常規(guī)脫蠟至水。

3.天青石藍液滴染2~3分鐘。

4.稍水洗。

5.Mayer蘇木精液滴染2~3分鐘。

6.稍水洗。

7.1%的鹽酸乙醇分化1-2秒。

8.流水沖洗10分鐘。

9.改良

VanGieson液滴染1~2分鐘。

10.急速用水洗一下,即用95%的乙醇快速分化。

11.無水乙醇脫水(I)、(Ⅱ)、(Ⅲ)各數(shù)秒鐘,二甲苯透明(I)、(Ⅱ)、(Ⅲ)各1~2分鐘。12.中性樹膠封固。（三）染色結果膠原纖維呈鮮紅色,肌纖維、胞質(zhì)及紅細胞呈黃色,胞核呈藍褐色。

染色結果

(四)注意事項

1.苦味酸水溶液的飽和度約1.2%,其干燥純品在高溫或受撞擊時會發(fā)生爆炸,為安全起見,廠商在出售時會加入水分35%以上,故在配制其飽和液時在100ml蒸餾水中加入含水的苦味酸約2g可達飽和。

2.特殊染色和組化染色的切片,一般切片厚度是4~5um,有時需要厚一些,則另有說明。

3.改良

VanGieson原法是用

Weigert鐵蘇木精染胞核,鐵蘇木精液為乙醇溶性,乙醇張力小,滴染時鐵蘇木精染液隨玻片擴散,不易控制,其配制的蘇木精用量也較大,故改用天青石藍液及

Mayer蘇木精液代替,該兩液很穩(wěn)定,染色效果好,染液的保存時間也較長。

4.1%的鹽酸乙醇分化常規(guī)是1~2秒,在分化完畢和流水沖洗后,應把切片放在顯微鏡下作低倍觀察。如核仍過深,可再分化0.5~1秒。如過淡,可再染天青石藍液和

Maver蘇木精液1次,然后再經(jīng)1%的鹽酸乙醇分化,至達理想為止。

5.改良

VanGieson染液分甲、乙兩液,應于臨用前按1:9的比例混合配成。如組織膠原纖維較少(如腦組織),則以1:7混合為宜。如把兩液預先混合,放置數(shù)天后,麗春紅S則不易著色。

6.改良

VanGieson液的麗春紅s易被水洗掉,苦味酸的黃色則易被95%的乙醇洗脫。因此,改良V.G.染色后,經(jīng)水洗或95%的乙醇洗時都要迅速。7.染改良V.G.液后,可不經(jīng)水洗,直接滴入95%