總黃曲霉毒素ELISA定量檢測試劑盒研制【摘要】目的研究并建立敏感、特異和快速的針對食品中總黃曲霉毒素的ELISA檢測方法，形成具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的快速定量檢測試劑盒。方法在生產(chǎn)抗總黃曲霉毒素單克隆抗體基礎(chǔ)上，利用間接競爭ELISA方法，研制出食品中總黃曲霉毒素快速檢測試劑盒，并對試劑盒的各項技術(shù)參數(shù)進(jìn)行測定。結(jié)果該試劑盒對黃曲霉毒素B+G標(biāo)準(zhǔn)品的最低檢出濃度為026ng／ml，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為026～2000ng／ml，線性方程y=-04463x+03532(R2=09915)；對黃曲霉毒素B+G50％的抑制濃度為208ng／ml；試劑盒的條內(nèi)變異系數(shù)為418％，條間變異系數(shù)為521％，抗體親和力常數(shù)為152×10-10mol／L；對玉米3個加標(biāo)水平的平均回收率分別為9863％，9456％和11205%；對花生的3個加標(biāo)水平的平均回收率分別為8866%，8750％和8560％。試劑盒37℃可放置96h以上；試劑盒對黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的交叉反應(yīng)率分別為100％，575％，104％和19％，與其他真菌毒素?zé)o交叉反應(yīng)。結(jié)論研制出的ELIS試劑盒能定量檢測食品中總黃曲霉毒素。

【關(guān)鍵詞】總黃曲霉毒素

黃曲霉毒素(Aflatoxin)是黃曲霉。同時黃曲霉毒素的毒性具有協(xié)同作用，因此，90％以上的國家都制定了食品中總黃曲霉毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)。目前總黃曲霉毒素的檢測方法主要有薄層層析法、色譜法。我國執(zhí)行的食品中總黃曲霉毒素B1+B2+G１+G2的國家標(biāo)準(zhǔn)測定方法是薄層色譜法和微柱篩選法，均為目測半定量法，最低檢出濃度為5μg/kg〔2〕。這些方法因受本身的限制，精確度低、敏感性差；樣品前處理過程復(fù)雜費時；或需要價格昂貴的儀器，檢測成本高，難以推廣應(yīng)用，影響了糧油食品中黃曲霉毒素的有效監(jiān)測。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)是在免疫學(xué)和細(xì)胞工程學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展的一種微量檢測技術(shù)，特別適合于對黃曲霉毒素污染監(jiān)控中大量樣本的篩檢。本研究以B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)以能分泌抗總黃曲霉毒素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株為基礎(chǔ)，建立了檢測玉米、花生中總黃曲霉毒素的ELISA檢測方法，并初步研制出具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的ELISA試劑盒。

1材料與方法

11材料

111主要儀器CO2培養(yǎng)箱(美國Queue公司)；潔凈工作臺(北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠)；生物倒置顯微鏡(日本歐林巴斯光學(xué)株式會社)；酶標(biāo)分析儀(瑞士SUNRIS公司）；電子分析天平(瑞士Mettler公司)；低溫高速離心機(jī)(德國Hermle公司)；電泳儀(美國BIO-RAD公司）等。

112試劑AFB1-BSA、黃曲霍毒素(B+G)(AflatoxinB+G)、黃曲霉毒素B1(AflatoxinB1，AFB1）黃曲霉毒素B2(AflatoxinB2，AFB2)、黃曲霉毒素G1(AflatoxinG1，AFG1)、黃曲霉毒素G2(AflatoxinG2，AFG2)、T-2毒素(T-2toxin)、赭曲霉毒素A(OchratoxinA)、展青霉素(Patulin)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivslenol，DON)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)、匙孔嘁血藍(lán)素(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、伏馬菌素B1、抗體亞類測定試劑盒(IgM，IgG，IgA，IgD，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3)；RPMI1640培養(yǎng)基、選擇性培養(yǎng)基、福氏佐劑(完全、不完全)、二甲基亞砜(DMSO)、吐溫20(Tween20)、聚乙二醇(PEG，MW5000)、青霉素，鏈霉素(美圍Gibco公司）；辣根過氧化物酶羊抗鼠IgG(北京中山試劑公司)；30％H2O2(優(yōu)級純，北京化工廠)。

113溶液系統(tǒng)ELISA使用液參考文獻(xiàn)［3］制備。

114細(xì)胞系與實驗動物小鼠骨髓瘤細(xì)胞系Sp2／0由本室傳代，并經(jīng)8一氮雜鳥嘌呤處理。雌性BALB／c小鼠，體重18～20g(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所動物繁育場)。

115抗總黃曲霉毒素雜交瘤細(xì)胞株本研究室自制。

12方法

121單克隆抗體生產(chǎn)將抗總黃曲霉毒素雜交瘤細(xì)胞注入BALB/c小鼠腹腔，獲得含抗總黃曲霉毒素單克隆抗體的腹水，并將所得腹水采用飽和硫酸銨鹽析法進(jìn)行純化〔4〕。

122抗體特性鑒定抗體的免疫球蛋白類別及亞類鑒定采用抗體亞類鑒定試劑盒；抗體的純度及分子量用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)測定；IgG含量采用二喹呆甲酸蛋白測定試劑盒進(jìn)行測定；抗體滴度測定采用間接非競爭ELISA方法：以AFB1-BSA為包被抗原，從1：10000倍開始將抗體進(jìn)行倍比稀釋，以Sp2／0細(xì)胞培養(yǎng)上清為陰性對照，以(A試驗-A空白)／≥21的最大稀釋倍數(shù)為滴定終點；抗體的特異性和抗體的靈敏度用間接競爭抑制性ELISA法進(jìn)行測定，參試毒素為黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、赭曲霉素A(OA)、伏馬菌素B1、T-2毒素和載體蛋白BSA。

13試劑盒各項技術(shù)參數(shù)研究

131方法的檢出限(靈敏度)用間接非競爭ELISA法作抗體滴度測定，找出合適的抗體工作濃度。再用間接競爭ELISA法作棋盤滴定，找出合適的包被濃度與毒素的競爭濃度，最后作標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定線性范圍及檢出限。

132方法的回收率試驗根據(jù)試劑盒的檢測范圍確定加標(biāo)濃度，在不含黃曲霉毒素的玉米和花生樣品中分別進(jìn)行高、低2個濃度的加標(biāo)回收試驗，每個加標(biāo)水平做5個重復(fù)的平行樣。樣品的提取方法為：樣品粉碎后使其90％通過250～500μm網(wǎng)篩。稱取5g加到100ml具塞三角燒瓶中，加入05gNaCl及25ml甲醇水溶液(70：30，v／v)，劇烈震蕩30min后過濾。濾液用純水稀釋10倍進(jìn)行檢測。樣品中黃曲霉毒素濃度(μg／Kg)=CDX／W。式中：C-酶標(biāo)板上測的黃曲霉毒素濃度(ng／ml)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得；D-樣品提取液的體積(ml)；X-稀釋倍數(shù)；W-樣品重量(g)。

132試劑盒穩(wěn)定性試驗對試劑盒穩(wěn)定性采用37℃加速破壞實驗進(jìn)行研究，將試劑盒分別放置于4℃和37℃，每隔24h進(jìn)行ELISA測定，測定陰性對照(不加毒素B0)和陽性(即50％的抑制毒素濃度B)的吸光度(A)值，計算兩者的比值(B／B0)。當(dāng)B006個吸光度(A)值，或B／B0

133方法的專一性(特異性)用交叉反應(yīng)率表示(見抗體特性鑒定)。

134方法的重復(fù)性方法的重復(fù)性亦即實驗室內(nèi)的變異程度，分別作加標(biāo)量為2μg/kg和4μg／kg的各5個平行樣的回收率，計算其平均回收率和變異系數(shù)。

134方法的再現(xiàn)性方法的再現(xiàn)性亦即實驗室間的變異程度，3個實驗室分別作加標(biāo)量為2和4μg／kg的各5個重復(fù)的回收率，計算3個實驗室間的變異系數(shù)。

2結(jié)果

21單克隆抗體特性鑒定雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的腹水抗體經(jīng)純化后，抗體滴度約為1：256×107，抗體的工作濃度為1：16×106?？贵w檢測黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2標(biāo)準(zhǔn)毒素的靈敏度分別為025，05，015和1ng／ml。該抗體的亞類為IgG1，抗體的親和力常數(shù)為152×10-10mol／L?？贵w的相對分子量約為150KD純化后IgG濃度為10g／L?？贵w與黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的交叉反應(yīng)分別為100％，575％，104％和19％；與T-2毒素、赭曲霉毒素A、展青霉素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、伏馬菌素B1等其他真菌毒素和牛血清白蛋白的交叉反應(yīng)均01％。

22試劑盒技術(shù)參數(shù)經(jīng)過棋盤滴定，抗體的最適工作濃度為1：16×106，AFB1-BSA的最適包被濃度為00625μg／ml。選擇黃曲霉毒素(B+G)標(biāo)準(zhǔn)品(0，0026，0052，013，026，052，13，26，52，13，26，52，130，260ng/ml)共14個濃度制作標(biāo)準(zhǔn)競爭校正曲線，線性方程y=-04463x+03532(R2=09915)，最低檢出濃度是026ng／ml，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍

為026～2000ng／ml，50％的抑制濃度為208ng／ml。試劑盒的條內(nèi)變異系數(shù)為418％，條間變異系數(shù)為521％。

23回收率測定對玉米做黃曲霉毒素(B+G)030，210和1040μg／kg3個加標(biāo)濃度的回收率實驗。其中03μ／kg加標(biāo)回收率的范圍為11205％～8804％，平均回收率9863％；21μg／kg加標(biāo)回收率的范圍為813％～8658％，平均回收率9456％，104μg/kg加標(biāo)回收率的范圍為11724％～10904％，平均回收率11205％。對花生做黃曲霉毒素(B+G)050，200和400μg／kg3個加標(biāo)濃度的回收率實驗。其中05μg/kg加標(biāo)回收率的范圍為10375％～7738％，平均回收率8866％；20μg／kg加標(biāo)回收率的范圍為10386％～7567％，平均回收率8750％；40μg/kg加標(biāo)回收率的范圍為9796％～7576％，平均回收率8560％。

24試劑盒穩(wěn)定性試驗經(jīng)37℃穩(wěn)定試驗，試劑盒在37℃下存放96h，超過96h后其吸光度值開始下降并A06。

25方法的重復(fù)性和再現(xiàn)性經(jīng)ELISA測定其2個加標(biāo)水平(20～40μg／kg)實驗室內(nèi)變異系數(shù)分別是41％和63％；實驗室間平均變異系數(shù)分別為79％和83％。

26方法的專一性將試劑盒所用抗體與T-2毒素、赭曲霉毒素A、展青霉素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、伏馬菌素B1等其他真菌毒素和牛血清白蛋白進(jìn)行交叉反應(yīng)試驗，其交叉反應(yīng)率均01％，說明該試劑盒有很好的專一性。

27試劑盒與HPLC方法驗證分別使用本研究研制的試劑盒和高效液相色譜方法對玉米、花生盲樣同時進(jìn)行檢測，并將2種方法的檢測結(jié)果進(jìn)行T檢驗，P005，說明2種方法對樣品的檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3討論

黃曲霉毒素對人和動物均產(chǎn)生嚴(yán)重的危害，是各國對糧食和飼料重點監(jiān)控的指標(biāo)。由于黃曲霉菌株培養(yǎng)物可同時產(chǎn)生AFB1、AFB2、AFG1和AFG2，而且黃曲霉毒素的毒性具有協(xié)同作用，因此，檢測食品中總黃曲霉毒素的污染水平具有重要意義。本研究在制備出針對黃曲霉毒素B1,B2、G1、G2均有較好的交叉反應(yīng)并且有較好的靈敏度和特異性的單克隆抗體基礎(chǔ)上，研制具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的總黃曲霉毒素ELISA檢測試劑盒。該試劑盒最低檢出濃度為026μg／kg，對樣品的最低檢出量為15μg／kg，與國外同類試劑盒靈敏度相似。試劑盒所用單克隆抗體與其他參試真菌毒素均無交叉反應(yīng)，具有較高的特異性。對玉米3個加標(biāo)水平的平均回收率為9863％，9456％和11205％，對花生的3個加標(biāo)水平的平均回收率為8866％，8750％和8560％，符合技術(shù)要求(70%～120％)。經(jīng)實驗室間驗證，此試劑盒再現(xiàn)性和重復(fù)性均較好，變異系數(shù)均20％。以上技術(shù)參數(shù)均達(dá)到試劑盒的技術(shù)要求，而且具有簡便、靈敏、快速，特異性好并可同時檢測大量樣品等優(yōu)點，值得推廣應(yīng)用。本研究成功地制備出針對黃曲霉毒素(B+G)具有高親合力、高特異性的單克隆抗體，建立了總黃曲霉毒素的ELISA檢測方法并研制出具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的總黃曲霉毒素ELISA檢測試劑盒，對開展全國性黃曲霉毒素污染調(diào)查及制定糧食中總黃曲霉毒素推薦限量標(biāo)準(zhǔn)建議值具有科學(xué)價值和應(yīng)用意義。

【參考文獻(xiàn)】

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