結(jié)直腸癌分子檢測系統(tǒng)解決方案

結(jié)直腸癌的分子標(biāo)志物以及臨床意義RAS基因與靶向治療，精準(zhǔn)是無限接近的方向BRAF基因帶來的思考MSI在結(jié)直腸癌中的方方面面PI3K的突變與腸癌阿司匹林治療結(jié)直腸癌分子標(biāo)志物檢測方法進(jìn)展合適的標(biāo)本更好的檢測合適的檢測技術(shù)精準(zhǔn)的結(jié)果19992000200120022003200420052006200720082009201020112012卡培他濱單藥美國依立替康

(+5-FU+葉酸)依立替康

(+5-FU+亞葉酸)奧沙利鉑(+5-FU+亞葉酸)卡培他濱聯(lián)合治療BEV+氟嘧啶為基礎(chǔ)的CTBEV+氟嘧啶為基礎(chǔ)的CTBEV+CT西妥昔單抗+化療(EGFR/

KRAS野生型)帕尼單抗+FOLFOX(EGFR/

KRAS野生型)歐盟奧沙利鉑(+5-FU+亞葉酸)瑞戈非尼

三/四線阿柏西普

(二線)西妥昔單抗+FOLFIRI(KRAS野生型)BEV:貝伐單抗;CT:化療;EGFR:表皮生長因子受體

FU:氟尿嘧啶;KRAS:克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物西妥昔單抗+化療(EGFR/

RAS野生型)2014無分子標(biāo)記物KRAS標(biāo)記物RAS標(biāo)記物mCRC治療方案的更新-從KRAS到RASRAS基因與靶向治療，精準(zhǔn)是無限接近的方向精選更合適的病人，從KRAS到全RAS基于分子標(biāo)志物的篩選刪選優(yōu)勢人群→增加療效隨機(jī)研究中>5,000患者的薈萃分析RASMT

53%RASWT

47%Sorich,etal.AnnOncol2015ITT100%ITT→KRAS→RAS，篩選出真正的優(yōu)勢人群KRASMT

42%KRASWT

58%RAS基因與靶向治療，精準(zhǔn)是無限接近的方向精選更合適的病人，從KRAS到全RASRCT研究回顧：抗EGFR單抗一線方案的OS獲益保持一致1.BokemeyerC,etal.JClinOncol32:5s,2014(suppl;abstr3505).

2.BokemeyerC,etal.AnnOncol.

2011;22(7):1535-15463.VanCutsemE,etal.JClinOncol.

2011;29(15):2011-2019.4.CiardielloF,etal.JClinOncol32:5s,2014(suppl;abstr3506).5.LenzH,etal.ESMO2014.abstract501O.

6.StintzingS,etal.2014ESMOAbstractLBA11.總生存期(月)FOLFIRI+cetFOLFIRI+cetFOLFIRI+cetFOLFOX+cetFOLFOX+cetFOLFIRI或FOLFOX+cet123456*與單用CT相比，P值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義**與CT+bev相比，P值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義FOLFIRI+bevFOLFIRI或FOLFOX+bevFOLFIRIFOLFIRIFOLFOXFOLFOXHR=0.80*HR=0.69*HR=0.86HR=0.78HR=0.9HR=0.697**4項(xiàng)RCT中，cet一線治療(k)RAS野生型mCRC的OS獲益趨于一致，均顯示出較單用CT或CT+bev更長的OSRAS基因與靶向治療，精準(zhǔn)是無限接近的方向?qū)で蟾行У闹委煼桨福琑AS野生型選用西妥昔更有優(yōu)勢臨床獲益程度評級基于療效,QoL,和毒性反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)置和描述1非治愈性級別設(shè)置:1(最低)-5(最高)*回顧性分析;?臨床實(shí)踐指南已不再推薦使用IFL

5抗-EGFR制劑在治療mCRC的測試中獲得了ESMO-MCBS標(biāo)準(zhǔn)的高評級

1.ChernyNI,etal.AnnOncol2015;26:1547–1573;2.VanCutsemE,etal.JClinOncol2015;33:692–700;

3.DouillardJ-Y,etal.NEnglJMed2013;369:1023–1034;4.HurwitzH,etal.NewEnglJMed2004;350:2335–2342;

5.NCCNClinicalPracticeGuidelines;ColonCancer,Version1.2015;

Availableat/professionals/physician_gls/pdf/colon.pdf.LastaccessedSept2015抗EGFRallRASwt抗EGFRallKRASwt抗VEGFinallline這種新的ESMO-MCBS工具支持了抗-EGFR制劑+CT與抗VEGF+CT相比作為一線治療方案治療RAS野生型mCRC的PFS和OS臨床獲益1RAS基因與靶向治療，精準(zhǔn)是無限接近的方向?qū)で蟾行У闹委煼桨福琑AS野生型選用西妥昔更有優(yōu)勢Right1。Left1。OS(mos)HazardRatio,95%confidenceInterval(RvL,adjuster)LogRankp-value(adjusted)ALLKRASwt19.434.21.56(1.32,1.84)<0.0001Cet16.437.51.97(1.56,2.48)Bv24.532.11.26(1.00,1.58)AllKrasmut8(0.95,1.73)PFS(mos)AllKRASwt8.911.51.25(1.08,1.46).002Cet7.712.01.54(1.25,1.91)Bv9.511.11.03(0.83,1.28)AlanP.Venook,DonnaNiedzwiecki,etal.ASCO2016(Abstract3504)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌原發(fā)腫瘤位置或預(yù)測生存期，與右半結(jié)腸相比較，源于左半結(jié)腸的癌癥會帶來較長的生存期在左半腫瘤患者中，接受西妥昔單抗治療相比于貝伐珠單抗治療會帶來較長的總生存期（36個月vs31.4個月）RAS基因與靶向治療，精準(zhǔn)是無限接近的方向圈定更相關(guān)的位置，左右位置的基因狀態(tài)與療效預(yù)后相關(guān)CALGB/SWOG80405

Ⅲ期臨床研究回顧性分析

3934例患者，接受輔助FOLFOX+/-西妥昔單抗治療、微衛(wèi)星穩(wěn)定性、III期結(jié)腸癌中BRAFV600E突變和KRAS2外顯子突變的預(yù)后意義RAS基因與靶向治療，精準(zhǔn)是無限接近的方向評價更遠(yuǎn)的未來，RAS基因的狀態(tài)與預(yù)后的關(guān)系PresentedByJulienTaiebat2015ASCOAnnualMeeting對腫瘤BRAFV600E和KRAS外顯子2基因突變進(jìn)行分析，僅將MSS患者納入組將患者分為BRAF突變，KRAS突變，和雙重野生型（WT）三組對基因突變與復(fù)發(fā)間期（TTR），復(fù)發(fā)后生存期（SAR），和總生存期（OS）相關(guān)性進(jìn)行分析RAS基因與靶向治療，精準(zhǔn)是無限接近的方向評價更遠(yuǎn)的未來，RAS基因的狀態(tài)與預(yù)后的關(guān)系在這個大樣本的合并分析中，顯示III期結(jié)腸癌、接受輔助FOLFOX+/-西妥昔單抗治療、MSS中BRAFV600E突變或KRAS2外顯子TTR,SAR,OS的獨(dú)立預(yù)后不良因素將來的臨床研究需要考慮這些因素作為重要的分層因素在將來的臨床實(shí)踐中，對III期結(jié)腸癌患者需考慮檢測MSI,RAS,BRAF與野生型腫瘤相比，密碼子12突變的腫瘤與更短時間內(nèi)復(fù)發(fā)顯著相關(guān)亞組分析顯示，KRAS僅影響遠(yuǎn)端腫瘤的復(fù)發(fā)和DFS（與近端腫瘤相比）KRAS密碼子12突變的患者復(fù)發(fā)風(fēng)險顯著增高BlonsHetal.AnnOncol2014Dec;25(12):2378-85

YoonHH.etal.ClinCancerRes2014Jun1;20(11):3033-43

KRAS密碼子12或13突變預(yù)示可手術(shù)切除的III期結(jié)腸癌患者生存期較短。與KRAS/BRAF野生型相比，KRAS密碼子12或13突變與無病生存期縮短有關(guān)KRAS密碼子12突變與錯配修復(fù)、近端腫瘤位點(diǎn)(低級別、年齡和性別有關(guān)）而密碼子13突變與近端位點(diǎn)有關(guān)RAS基因與靶向治療，精準(zhǔn)是無限接近的方向評價更遠(yuǎn)的未來，RAS基因的狀態(tài)與預(yù)后的關(guān)系PinoMS,etal.Gastroenterology.2010Jun;138(6):2059-72.結(jié)直腸癌發(fā)生途徑：CIN和MSI途徑CIN途徑（染色體不穩(wěn)定）-經(jīng)典模型：正常-腺瘤-癌占85%MSI途徑：包括幾乎所有的Lynch綜合征（胚系突變），以及10-15%的散發(fā)性結(jié)直腸癌散發(fā)性結(jié)直腸癌CIMP高表達(dá)使表基因沉默引起MSI，該途徑受MAPK/ERK信號通路控制，BRAF是其重要的調(diào)控因子，因此散發(fā)的MSI途徑結(jié)直腸癌中，約有40%到60%出現(xiàn)BRAF突變，在MSS的結(jié)直腸癌中這一幾率只有5%-10%，而且BRAF突變的腫瘤都不是胚系突變。K-RAS突變在結(jié)直腸癌是早期的分子事件BRAF基因帶來的思考BRAF基因與MSIBRAF突變狀態(tài)療效分析：一項(xiàng)納入2530例患者的研究BRAF基因帶來的思考BRAF突變的預(yù)后及治療方案的選擇

BRAF突變型患者的OS更短，后續(xù)治療比例更低Seligmann,etal.ASCO20151L治療

BRAFMTvsBRAFWTOS1L治療BRAFMT患者中位OS明顯縮短；接受2L治療的BRAFMT僅有39%，而BRAFWT患者為60%OS預(yù)估時間(月)0612182430364200.250.500.751.00OS預(yù)估時間(月)03691215182400.250.500.751.00BRAFWT

BRAFMTHR=1.48

p<0.001BRAFWT

BRAFMTHR=1.17

p=0.33216.910.210.816.42L治療OSforBRAFMTvsBRAFWTBRAF基因帶來的思考BRAF突變的預(yù)后及治療方案的選擇低強(qiáng)度高強(qiáng)度預(yù)后差的患者應(yīng)給予最強(qiáng)的治療方案

BRAF突變型患者在一線應(yīng)給予最強(qiáng)的治療方案氟尿嘧啶類藥物+貝伐珠單抗雙藥化療+貝伐珠單抗雙藥化療+西妥昔單抗三藥化療（FOLFOXIRI）+貝伐珠單抗三藥化療（FOLFOXIRI）+西妥昔單抗BRAF基因帶來的思考BRAF突變的預(yù)后及治療方案的選擇2014ESMO指南:mCRC目標(biāo)導(dǎo)向的治療策略VanCutsemE,etal.AnnOncol2014;25(Suppl3):iii1–iii91組:起初不可切除的轉(zhuǎn)移性癌癥患者2組:不可切除的轉(zhuǎn)移性高腫瘤負(fù)荷或出現(xiàn)腫瘤相關(guān)癥狀的患者

3組:明確不可切除的轉(zhuǎn)移性，無癥狀性及較低侵襲性或合并癥癌癥患者轉(zhuǎn)化為可切除的癥狀控制生存時間

和QoL強(qiáng)化治療次強(qiáng)化治療0組:起初可切除的轉(zhuǎn)移性癌癥患者治愈QoL，生存質(zhì)量RAS,BARF基因檢測指南推薦與臨床系統(tǒng)解決方案VanCutsemE,etal.‘TheESMOconsensusonmetastaticCRC–2015’(presentedatWCGC2015);availableathttp://web.oncoletter.ch/files/cto_layout/Kongressdateien/WCGIC2015/ESMO%20Guidelines%20(2).pdf

2015ESMO指南治療——根據(jù)不同的治療目標(biāo)選擇方案患者的臨床分類適合強(qiáng)化治療目標(biāo)不適合(但可能適用)FP+/-貝伐珠單抗

減量雙聯(lián)化療，抗EGFR抗體不適合強(qiáng)化治療BSCNED單純手術(shù)手術(shù)伴圍手術(shù)期/術(shù)后CT轉(zhuǎn)移灶明顯可切除的患者疾病控制(控制進(jìn)展)細(xì)胞數(shù)減少(腫瘤縮小)分子型分子型RASwtBRAFmtRASmt雙聯(lián)化療+抗EGFR抗體三聯(lián)化療+貝伐珠單抗雙聯(lián)化療+貝伐珠單抗再評估/每2個月評估腫瘤緩解情況目標(biāo)手術(shù)細(xì)胞數(shù)減少(腫瘤縮小)疾病控制疾病進(jìn)展繼續(xù)繼續(xù)維持治療或暫停RASwtBRAFmtRASmtCT+抗EGFR抗體/貝伐珠單抗不常見參見文章CT+貝伐珠單抗再評估/每2-3個月評估腫瘤緩解情況繼續(xù)維持治療或暫停疾病進(jìn)展二線二線被診斷為結(jié)直腸癌的年齡小于70歲的患者70歲以上但滿足Bethesda標(biāo)準(zhǔn)都應(yīng)該檢測MSI或者M(jìn)MR確認(rèn)是否是林奇綜合征，并且在MLH1型的存在BRAFV600E突變的患者可以排除林奇綜合征MSI在結(jié)直腸癌中的方方面面MSI與林奇綜合征

MSI-H的CRC患者接受氟尿嘧啶單藥輔助化療無獲益C.RichardBolandetal.Gastroenterology.2010June;138(6):2073–2087.MSI在結(jié)直腸癌中的方方面面治療上化療相關(guān)以及提示預(yù)后具有MS-L/S（微衛(wèi)星不穩(wěn)定性低）的BRAF突變患者OS更差A(yù)rnaudD.Roth.etal.JClinOncol.2010.28:466-474.BRAF突變檢測，可與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）同時進(jìn)行，用來進(jìn)行預(yù)后分層MSI在結(jié)直腸癌中的方方面面治療上化療相關(guān)以及提示預(yù)后2016NCCN指南所有Ⅱ期的結(jié)直腸癌患者都應(yīng)該檢測MSI或者M(jìn)MR，微衛(wèi)星不穩(wěn)定性高的MSI-H患者具有更好的預(yù)后，同時對5-FU的治療不敏感MSI或者M(jìn)MR與BRAF的配合檢測與林奇綜合癥篩查有關(guān)，也與預(yù)后和化療相關(guān)MSI在結(jié)直腸癌中的方方面面治療上化療相關(guān)以及提示預(yù)后LeDT.Etal.NEnglJMed.

2015Jun25;372(26):2509-20.LBA100：一項(xiàng)納入41例CRC患者Ⅱ期臨床研究

PD-1阻斷抗體Pembrolizumab單藥治療MSI進(jìn)展轉(zhuǎn)移性CRC患者客觀緩解率達(dá)40%，疾病穩(wěn)定78%；而MSS患者客觀緩解率與疾病穩(wěn)定分別為0%與11%。基于MSI分型的免疫治療-開辟另一個新時代MSI在結(jié)直腸癌中的方方面面PIK3CA突變檢測與AspirinMortalityamongPatientswithColorectalCancer,AccordingtoRegularUseorNonuseofAspirinafterDiagnosisandPIK3CAMutationStatus結(jié)直腸癌的分子標(biāo)志物以及臨床意義RAS基因與靶向治療，精準(zhǔn)是無限接近的方向BRAF基因帶來的思考MSI在結(jié)直腸癌中的方方面面PI3K的突變與腸癌阿司匹林治療結(jié)直腸癌分子標(biāo)志物檢測方法和規(guī)范化合適的標(biāo)本更好的檢測合適的檢測技術(shù)精準(zhǔn)的結(jié)果1.組織標(biāo)本的處理?推薦使用10%中性福爾馬林緩沖液（4%甲醛液）固定?固定時間應(yīng)該不少于6小時，不長于48小時；使用微波增強(qiáng)的固定方法，則必須確認(rèn)核酸和蛋白質(zhì)二者的質(zhì)量?擬行標(biāo)志物檢測的組織塊應(yīng)該進(jìn)行理想切片并盡快分析2.分子標(biāo)志物檢測的標(biāo)本選擇?審查所有可獲得的腫瘤標(biāo)本，以挑選出最適合進(jìn)行分子標(biāo)志物分析的標(biāo)本?推薦在DNA提取前進(jìn)行標(biāo)本的顯微切割，以富集標(biāo)本中的腫瘤細(xì)胞含量（>50%）3.基因檢測快速、高效的將組織標(biāo)本從送檢中心轉(zhuǎn)運(yùn)到檢測實(shí)驗(yàn)室，避免時間被延誤，從檢測部門收到標(biāo)本到發(fā)布最終報(bào)告，>90以上的標(biāo)本，耗時應(yīng)該≤7個工作日臨床應(yīng)用開展前應(yīng)該對檢測方法進(jìn)行驗(yàn)證（或認(rèn)證）并記錄，備有實(shí)驗(yàn)稽查機(jī)制。提供基因檢測的實(shí)驗(yàn)室，參與的外部質(zhì)量評估流程，并得到適合的認(rèn)證合適的標(biāo)本更好的檢測原發(fā)腫瘤與轉(zhuǎn)移腫瘤中KRAS表現(xiàn)為高度一致性Whatistheappropriatesampleforcolorectalmolecularmarkertesting?7.ExpextConsensusOpinion:Molecularmarkertesting(KRAS,extendedRAS,BRAF,anddMMR/MSI)oftheprimarycolorectalcarcinomatissueisacceptable.Ifmetastaticcolorectalcarcinomatissueisavailabe,itisalsoanacceptablespecimen(preferableinpatientswithmetastaticdisease).Box1MainrecommendationsforRAStestingofcolorectalcarcinomatoguideanti-EGFRtherapyEitherPrimaryormetastaticCRCtissuecanbeusedforRAStesting.EitherbiopsyorresectionspecimentissuecanbeuesdforRAStesting,thoughifbothareequallyavailable,useofresectiontissueispreferable.25合適的標(biāo)本更好的檢測來源于腸道原發(fā)瘤或肝轉(zhuǎn)移的組織均可以用于RAS基因突變檢測其他轉(zhuǎn)移部位例如淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或肺轉(zhuǎn)移僅在肝轉(zhuǎn)移瘤組織不可獲得時使用液態(tài)活檢*:一種快速、微創(chuàng)的生物標(biāo)記物檢測新方法1.DiehlF,etal.ProcNatlAcadSciUSA2005;102:16368–16373;

2.DiehlF,etal.NatMed2008;14:985–990液態(tài)活檢*微創(chuàng)快速獲得結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏1,2避免腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的選擇性偏倚1,2掌握最新突變情況臨床獲益使得在診斷時既能選擇最佳個性化治療方案提供患者最新突變情況未來潛力動態(tài)監(jiān)測生物標(biāo)記物的變化和治療效果便于通過新生物標(biāo)記追蹤新亞型從而選擇新的靶向治療*與MerckKGaA(Darmstadt,Germany)合作的，采用SysmexInostics液體活檢技術(shù)，針對RAS的CE標(biāo)記的體外診斷試劑(IVD)預(yù)計(jì)會在2015年推出(“僅供研究”的試劑盒已準(zhǔn)備就緒)用于液態(tài)活檢*的

“僅供研究”的試劑盒已準(zhǔn)備就緒合適的標(biāo)本更好的檢測ECC2015薈萃分析:mCRC患者液態(tài)活檢*和

基于組織的RAS檢測結(jié)果的高度一致性JonesFS,etal.ECC2015(AbstractNo.2012)一致率,

n/N(%)歐洲和亞太地區(qū)研究的匯總數(shù)據(jù)IV期(mCRC)陽性結(jié)果一致性36/39(92.3)陰性結(jié)果一致性29/29(100)總體一致性65/68(95.6)RAS突變的發(fā)生率:血漿(55%)vs腫瘤組織(57%)*與MerckKGaA(Darmstadt,Germany)合作的，采用SysmexInostics液體活檢技術(shù)，針對RAS的CE標(biāo)記的體外診斷試劑(IVD)預(yù)計(jì)會在2015年推出(“僅供研究”的試劑盒已準(zhǔn)備就緒)Onc兩項(xiàng)研究均包括采用oBEAM?ExpandedRAS面板分析血樣RAS突變以及采用Sanger或焦磷酸測序技術(shù)鑒別FFPE腫瘤樣本(來源于原發(fā)或mCRC腫瘤組織)中RAS突變情況組織樣本的采集時間與血液樣本的采集時間相匹配mCRC病例:46例新診斷患者和22例出現(xiàn)進(jìn)展/復(fù)發(fā)病例合適的標(biāo)本更好的檢測研究類型：多中心研究，計(jì)劃入選10家中心，競爭入組（2000例，每家中心半年檢測樣本例數(shù)≥200例）入組標(biāo)準(zhǔn)：晚期結(jié)直腸癌患者入組病例需提供組織K/N/B突變（ADx-ARMS法）檢測結(jié)果；若僅提供RAS檢測結(jié)果，需留取適量腫瘤組織或腫瘤組織DNA，用于BRAF檢測（艾德中心實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)一集中檢測）。能夠同時提供和組織時間配對的血漿樣本。標(biāo)本類型：全血10ml（EDTA抗凝全血）檢測方法：采用廈門艾德公司自主開發(fā)的KRAS/NRAS/BRAF基因突變聯(lián)合檢測SuperARMS試劑盒進(jìn)行檢測。晚期CRC患者血液與組織KRAS、NRAS、BRAF突變狀態(tài)的對比及與臨床相關(guān)性研究ME-PCR/

SequencingO=Transferproduct/addreagent/opentubePCR:

Real-time

DetectionPCRClean-upSequencingRxnCapillarySequencingPCRPCRClean-upSequencingRxnCapillarySequencingPCRHetero-

duplexCapillaryElectro-phoresisARMS&PNA-LNAclampPCR/SequencingNested

PCR/SequencingPCR/

HRMA/

dHPLC

PCR/

RFLPPCRRFLPElectro-phoresisSizingPCRPCRClean-upSequencingRxnCapillarySequencingRFLPOOOOOOOOOOOOTaqMan

Clean-upOClean-upOClean-upOOOOPCRSURVEYORcleavagedHPLCSizingOConfirmationbysequencingPCR/

SURVEYORPCRClean-upPyro-sequencingRxnPyro

SequencingOO123456Steps7Confirmationbysequencing