1、流式細(xì)胞儀上的FL2-WFL2-AFL2-H分別是做什么的？

FL2-W是只檢測熒光的脈沖寬度，F(xiàn)L2-H是指脈沖高度。通常在做細(xì)胞周期分析時應(yīng)用，用于去除粘連細(xì)胞。

2、流式同型對照怎樣選擇？

同型對照（IsotypeControl）：使用與一抗相同種屬來源、相同亞型、相同劑量和相同的免疫球蛋白及亞型的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞表面而產(chǎn)生的背景染色。如果一抗是多抗，可以用annormalserum（與一抗相同的正常血清）（mustbethesamespeciesasprimaryantibody）。Thiscontroliseasytoachieveandcanbeusedroutinelyinimmunohistochemicalstaining.這個可以咨詢試劑商。同型對照為免疫熒光標(biāo)記中的陰性對照。由于熒光標(biāo)記單抗的組來源不同，應(yīng)選用相同來源的未標(biāo)記單抗作為同型對照來調(diào)整背景染色。舉個例子：比如檢測一抗為單抗的mouseantiratCD11b，cloneOX-42purifiedIgG，那么它的isotype是mouseIgG2a，所以可以用purified（純化的）mouseIgG2a來做OX-42的同型對照（IsotypeControl）。一般的的生物技術(shù)公司和國內(nèi)的代理都有出售。

同型對照：是指與MoAb相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亞類，若使用直接免疫熒光染色法，同型對照也應(yīng)標(biāo)記熒光色素，如IgG1FITC、IgG2ａ、PE等。主要考慮了細(xì)胞的自發(fā)熒光、FC受體介導(dǎo)的抗體結(jié)合和非特異性抗體結(jié)合等影響因素。此外，同型對照與MoAb所標(biāo)記的熒光色素、濃度、F：P比值（標(biāo)記的熒光色素與免疫球蛋白分子的比值）應(yīng)該相同為最佳，這對準(zhǔn)確設(shè)定陰性與陽性細(xì)胞的界標(biāo)有重要意義，切忌使用與MoAb不相匹配的同型對照，最好為同一實驗室、采用相同工藝或方法制備（如同一品牌）的產(chǎn)品。

3、流式細(xì)胞技術(shù)測定細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度為何要使用氯化鈣.在文獻(xiàn)及其他專業(yè)網(wǎng)站中都有測定游離鈣的方法，具體如下：

（1）鈣熒光探針負(fù)載；

（2）隨機(jī)測定每管細(xì)胞懸液樣品（以下簡稱樣品）的單個細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，記為F值。

（3）加入10%TritonX100，（破膜用）；加入1mmol/L氯化鈣，（問題所在），吹打均勻，孵育1~10min，測定熒光即Fmax值。

（4）加入EGTA，20μl（鈣螯合劑），孵育1~10min，激發(fā)波長488nm測定熒光，即Fmin值。

這個過程中的氯化鈣的作用如何，請高人指點，謝謝。

因為正常血漿中Ca2＋濃度是1mM，細(xì)胞外液的Ca2＋對細(xì)胞內(nèi)Ca2＋有影響。加0.1%triton是增加膜通透性，使細(xì)胞外Ca2＋進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，作為最大值。加EGTA是為了螯合Ca2＋，作為最小值.生理環(huán)境中細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度遠(yuǎn)低于細(xì)胞外液（大約1：10000），細(xì)胞膜對鈣的通透性變化對細(xì)胞內(nèi)鈣影響很大。

4、流式與werstern的區(qū)別，知道一些，不足之處請大家補(bǔ)充：

（1）Western是檢測蛋白表達(dá)的金標(biāo)準(zhǔn)，可用于檢測細(xì)胞多種類型的蛋白；流式細(xì)胞術(shù)的方法多用于檢測細(xì)胞膜蛋白，雖然也可通過Triton-X100給細(xì)胞打孔的方法來檢測胞內(nèi)蛋白，但對于分泌蛋白卻是無能為力的；

（2）Western測蛋白含量對抗體的量需要很少，一般1：1000左右，而流式對抗體的需要量很大，一般1：50（很浪費抗體）；

（3）采用Western方法檢測細(xì)胞蛋白含量的變化一般要有內(nèi)參，而流式一般要把每個樣品分為兩份，同時都做只加二抗（FITC標(biāo)記的）的對照，這樣平均到每個細(xì)胞的發(fā)光就不用內(nèi)參了；

（4）就個人經(jīng)驗而言，流式用多抗不好，單抗標(biāo)出來不錯。

不過流式的應(yīng)用原理主要還是抗原和抗體反應(yīng)和western、免疫組化沒有本質(zhì)差別，但是由于免疫組化和western都有酶催化底物的放大體系，因此，流式不適合檢測低表達(dá)的蛋白，低表達(dá)的還是采用western（尤其是化學(xué)發(fā)光底物更佳）和免疫組化更好。當(dāng)然，流式最大的一個特點就是，可以定量（百分比），如果是高表達(dá)的用流式細(xì)胞儀非常有優(yōu)勢。

5、FL1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3的區(qū)別是什么?是指在不同位置測得的熒光?還是不同波長的熒光?這3個參數(shù)到底測的是什么?有什么意義?

你的理解是正確的，其實FL1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3是指不同的熒光通道.舉個例子來說吧.我們用FITC/PE雙標(biāo)記的細(xì)胞，在488nm的激光激發(fā)下，這兩種熒光染料分別發(fā)出波長不同的綠色和橙色熒光，然后這發(fā)出的熒光再通過濾光片分開，對應(yīng)的是不同的波長的濾光片，一般在fl1那的是530nm的濾光片，在FL2那的是575nm的濾光片，這樣就可以把在一起的熒光分開了。

6、用于做Western或ELISA的一抗可否用于流式細(xì)胞術(shù)？

看你說明書上是怎么說的了，如果沒有說就不可以做流式，需要另外買了。

7、MFI和GFI的意義？

GeoMean，叫做幾何均數(shù)（geometricmean），常用于等級資料和對數(shù)正態(tài)分布資料，和常用的算數(shù)均數(shù)（mean）的計算方法不同?！?total或者%gate的結(jié)果”代表的是百分率，即細(xì)胞占總體細(xì)胞或者是門內(nèi)細(xì)胞的百分比；用百分比作為統(tǒng)計指標(biāo)，適用于熒光表達(dá)較強(qiáng)的指標(biāo)。我看到你的流式圖上，檢測樣本的熒光強(qiáng)度不是很強(qiáng)，屬于弱表達(dá)的指標(biāo)，若用百分率統(tǒng)計，就是會失去一部分弱陽性的數(shù)據(jù)。我建議可以用平均熒光強(qiáng)度（也就是mean值）作為統(tǒng)計指標(biāo)，比較熒光強(qiáng)度的變化。

8、流式技術(shù)中的APC，pure標(biāo)記是什么意思呢?

熒光物質(zhì)通常是指那些在受到一個波長激發(fā)后，處于一個能量不穩(wěn)定的狀態(tài)，能發(fā)射一個untiltheyarerunforflowanalysis.Thesamplesshouldbeanalyzedwithin48hours.Fluorescencelosesitsbrightnessifcellsarenotkeptproperly：notat40C，orareexposedtolight

（2）Ifcellsarenotfixedwithparaformaldehyde，keepthesamplesoniceandrunthemimmediatelyafterstainingisaccomplished

因此，如果你沒有用PBS洗的話，可以用paraformaldehyde固定，放置48小時。洗了后應(yīng)該盡快檢測。如果做好不能及時檢測，我們一般是加入等量的2%的多聚甲醛固定，4度冰箱避光貯存。一般過夜沒有問題，第二天同樣PBS2ml洗滌細(xì)胞一次，上機(jī)檢測。

18、如何分選原始紅細(xì)胞？

CD71（轉(zhuǎn)鐵蛋白受體）--幼稚細(xì)胞的標(biāo)記

CD235（GPA）--紅細(xì)胞的標(biāo)記（小鼠有Ter119）

雙陽性細(xì)胞即為幼稚紅細(xì)胞，但無法區(qū)分原始及中晚幼紅.

19、請問流式檢測膜蛋白表達(dá)的變化用多克隆抗體出結(jié)果的機(jī)會大嗎？

流式的抗體和WB的抗體是不同的（有部分可以通用），多抗一般是大的變性蛋白為抗原制備的，而WB的中被檢測蛋白就是變性狀態(tài)，所以很吻合，而流失中一般蛋白還是保持了天然構(gòu)象，所以產(chǎn)生的多抗可能不太好，而需要用很小特定的決定簇為抗原制備單克隆抗體。

20、在下最近作人外周血流式，作表面及其胞內(nèi)染色，試劑說明書說要先分離外周血單個核細(xì)胞再染色，我有時候分的紅細(xì)胞比較多，其他的方法試過了，都改進(jìn)的不好，我擔(dān)心紅細(xì)胞會有影響，想在分離出PBMC以后如果紅細(xì)胞比較多的話，就用紅細(xì)胞裂解液裂解一下，但是我有如下問題，希望這樣做過的同志指點一下，感激不禁。

（1）有人這樣在分離PBMC以后再裂解的嗎（我知道一般是在全血染色后再裂解紅細(xì)胞）？

（2）這樣會影響流式檢測嗎？

（3）用的裂解液配方是什么（最好是自己用過的）。

（4）用法是什么｛我是在如果PBMC分出來以后要是紅細(xì)胞比較多的時候使用，這樣要怎樣把分出的PBMC稀釋，加多少裂解液裂解多長時間，裂解后洗滌幾次等等｝。

我曾做骨髓液分離單個核細(xì)胞而后做流式，一般來說用Ficoll分過之后即便還有紅細(xì)胞殘留，上流式也可通過“設(shè)門”根據(jù)細(xì)胞形態(tài)大小將紅細(xì)胞剔除。若紅細(xì)胞殘留太多，則可通過紅細(xì)胞裂解液進(jìn)一步去除之。我用的裂解液配方是：

碳酸氫鉀（KHCO3）1.0g

氯化氨（NH4CL）8.3g

EDTA-Na20.037g加雙H2O至1000ml，為工作液。

配好后4度冰箱保存，使用時效果更好。我是在Ficoll分過之后用的，所以一般根據(jù)離心后EP管里細(xì)胞團(tuán)的大小加紅細(xì)胞裂解液，通常5ml骨髓液分離單個核細(xì)胞后得到的細(xì)胞再加500ul裂解液，震蕩混勻置2－5分鐘紅細(xì)胞就基本上裂解干凈了。洗滌次數(shù)看白細(xì)胞多少而定，因為洗的次數(shù)越多，損失就越多。我一般洗一到兩次就OK了．做了很久沒發(fā)現(xiàn)這樣處理影響結(jié)果。有一點，我是在這樣處理后才標(biāo)記抗體的，樓上的說是標(biāo)記過才溶紅細(xì)胞，所以建議在溶的時候時間不宜過長，洗滌次數(shù)也不宜過多，以免將標(biāo)記上的單抗洗脫。

21、請問下表中流式細(xì)胞儀給出的平均值是什么意思，是怎樣得到的，有些文獻(xiàn)中提到“fluorescencepercell"，是下面的mean值嗎，還是要用mean值除以第1欄的細(xì)胞數(shù)events，才能得到fluorescencepercell？

mean值就是每個細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度，不用再除細(xì)胞數(shù)。這只是個相對值，如果求絕對值，應(yīng)用已知熒光劑濃度值對應(yīng)儀器給出的mean值，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。以后你得到的mean值，就可以根據(jù)這條標(biāo)準(zhǔn)曲線查出真正的熒光濃度值。

22、流式中檢測細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)水平的抗體有何區(qū)別？

抗體只是針對相應(yīng)抗原的，至于是針對胞內(nèi)還是胞膜對你檢測來說并無明顯影響，你只需要查清楚到底是針對哪一個部位的抗原的，應(yīng)該是可以用同一種抗體進(jìn)行檢測的，在流式操作時只需注意：如果是針對胞內(nèi)，則需要加破膜劑，讓抗體能和相應(yīng)抗原接觸，否則就不需要了。

23、請教各位前輩：只要是熒光抗體久可以用于共聚焦顯微鏡嗎？

一般情況下都是可以的。但有時候強(qiáng)度不夠，需要選擇熒光強(qiáng)度大的染料，比如Alexa系列的。

24、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期是否需要雞紅細(xì)胞作參照？

不用，標(biāo)準(zhǔn)微球做完laseralignment（光路校正）就可以了。盡量把微球的各色CV值控制在1.5以內(nèi)。

25、我現(xiàn)在要用間接法流式細(xì)胞術(shù)，剛買了熒光二抗，是KPL的fluorescein-labeledaffinitypurifiedantibodytomouseIgG+IgM（H+L）producedingoat.說明說上提示要用TBS或是BSA或milkdiluent/blockingsolution液稀釋。稀釋至1：10～1：100。請問BSA是不是小牛血清，要用多少濃度的。TBS液我沒有，還有可否用注射用水稀釋。

BSA：牛血清白蛋白，濃度可以在一定范圍內(nèi)1%~5%，具體可參考其他抗體說明書。

TBS：Trisbuffersaline。就是Tris的鹽溶液，很常規(guī)的溶液，配方：20mMTris-HCl（ph8.0），150mMNaC