種保存程序.目的規(guī)范菌種保存程序。.適用范圍微生物實驗室保存的標準菌株和來自臨床的標本菌株。.職責(zé)微生物實驗室檢驗人員正確執(zhí)行本程序。.程序需氧菌保存法一般保存法見下表。表：常見菌種培養(yǎng)基保存期限菌種培養(yǎng)時間培養(yǎng)基保存溫度（℃）保存時間流感嗜血桿菌18?24脫纖維羊血或脫脂牛奶-206個月葡萄球菌、鏈球菌18?24血瓊脂斜面（高層加液體石蠟）4?81?3個月腸桿菌科18?24Soxbean酪蛋白瓊脂（高層加液體石蠟）4?81年腸桿菌科、非發(fā)酵菌、葡萄球菌等18?24牛肉湯（6份肉湯+4份甘油或10%胰大豆肉湯或10%?15%甘油）-206個月苛養(yǎng)葡18?245%小牛血清肉湯-206個月分枝桿葡18?24歲氏培養(yǎng)基（加液體石蠟）4?83個月幽門螺桿菌18?24心腦浸出液或布氏湯加入甘油-706年注：待保存菌種均需培養(yǎng)18?24小時。冷凍干燥法將待保存菌種培養(yǎng)18—24小時后，挑取菌落加入一定量的牛肉湯或心腦浸出液加入20%蔗糖，混勻，分裝于安甑瓶中，置低溫冰箱保存。大多數(shù)菌株可以保存10年以上，甚至更長。1.3超冰凍法保存菌株初代培養(yǎng)18?24小時的菌落、菌苔，加入0.5?1.0ml無菌脫纖維羊血安甑中，封口，置液氮或-40℃冰箱中保存。厭氧菌保存法短期保存方法庖肉培養(yǎng)基保存法用牛肉渣和牛肉浸出液制成庖肉培養(yǎng)管，接種待保存菌株，然后覆蓋1?2cm的石蠟，再將培養(yǎng)管垂直放置片刻，待石蠟?zāi)讨?5c培養(yǎng)（無芽胞厭氧菌培養(yǎng)72小時，普通梭菌培養(yǎng)24小時，產(chǎn)氣莢膜梭菌和多枝梭菌培養(yǎng)2周左右），最后置室溫或-20C保存。發(fā)酵糖類的厭氧菌每個月轉(zhuǎn)種一次，不發(fā)酵糖類的厭氧菌3?6個月轉(zhuǎn)種一次。半固體培養(yǎng)基保存法在上述液體培養(yǎng)基中加入0.2%?0.5%瓊脂，制成半固體培養(yǎng)基，接種時用毛細管將待保存的厭氧菌的菌液加入半固體培養(yǎng)管底，表面加入1?2cm厚度的液體石蠟，密封管口，培養(yǎng)48小時，置室溫或-20C保存。421.3甘油乳劑培養(yǎng)基保存法在厭氧液體培養(yǎng)基（含胰蛋白腺、牛肉膏、酵母浸粉、L一半胱氨酸和維生素K等）中加入少量牛肉渣分裝于長試管中，接種待保存菌株，置35℃培養(yǎng)48?72小時，取出后加入無菌甘油（按1：1比例），蓋緊蓋了后用石蠟封口，置4℃或-20C保存。此法適用于保存脆弱擬桿菌、產(chǎn)黑色素普雷沃菌和具核梭桿菌。長期保存法低溫冷凍保存法（厭氧菌在低溫條件下新陳代謝處于抑制狀態(tài)，不繁殖也不死亡），培養(yǎng)基包括脫纖維羊血、兔血或馬血，20%脫脂牛乳，7.5%葡萄糖的馬血清。將待保存菌株（培養(yǎng)24?48小時）加入上述培養(yǎng)基中，封好瓶口，置-70C液氮或-70C低溫冰箱中保存。菌種不同造成保存時問差異，最長可保存10年，最短可保存2年以上。冷凍真空干燥法冷凍真空干燥法的培養(yǎng)基（保存劑）有兩種，一種是用10%—20%脫脂牛奶加入0.1%的谷氨酸鈉和0.03%的L一半胱氫酸，煮沸15分鐘消毒，冷卻備用。另一種是用10%蔗糖與馬血清混合液，過濾滅菌，并置厭氧環(huán)境中預(yù)還原，分裝備用。將培養(yǎng)48小時左右（處于生長靜止期）的厭氧菌落或菌苔刮下，加入一定量的上述培養(yǎng)基，混勻分裝于安甑中，置-20C低溫冰箱中迅速凍結(jié)，再放入冷凍干燥機內(nèi)，抽真空16?24小時，然后將安甑封口，置4c環(huán)境下長期保存。結(jié)核分枝桿菌保存法短期保存方法（懸浮液低溫保存法）結(jié)核分枝桿菌充分懸浮于經(jīng)高壓滅菌的20%丙三醇一生理鹽水中，保藏在-20℃。使用該方法，大部分分支桿菌能保存1年以上。長期保存方法（懸浮液超低溫保存法）10mg結(jié)核分枝桿菌充分懸浮于凍存溶液（6g胰蛋白膝溶于100ml20%丙三醇水溶液）中，保藏溫度為-70℃。使用該方法，大部分分支桿菌能保存5年以上。真菌菌種保存法冰凍保存法冰凍保存有助與抑制真菌，尤其是抑制皮膚癬菌發(fā)生多形性變化，即異變（當其培養(yǎng)物變成白色蓬松絨毛狀時，真菌就失去所有特征性的顏色及形態(tài)學(xué)特征，甚至?xí)Ｖ巩a(chǎn)生各種抱子，由此會導(dǎo)致菌種鑒定困難）。真菌接種在沙氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)8?10日或直至見到菌落將近要全面覆蓋培養(yǎng)基時，將試管置于-20C冰箱中保存。石蠟油保存法真菌接種于沙氏瓊脂上，25℃培養(yǎng)基，酵母菌2?4日，產(chǎn)抱子的絲狀真菌需形成成熟的抱子，不產(chǎn)胞子的真菌生長成健壯的菌絲為止。覆蓋2cm的無菌石蠟（礦物）油（石蠟油的火菌一般在一個小時以上，然后將白然冷卻的石蠟油加入含真菌的試管中，使液而高于斜而頂部1cm左右）。使用此辦法，許多真菌可在室溫下存活數(shù)年。在恢復(fù)培養(yǎng)時，先從石蠟油下面挑取一塊（2?3mm3）菌落，沿試管壁邊挑取邊擠壓過多的石蠟油（因石蠟油過多會抑制真菌生長），然后接種于沙氏瓊脂斜面上，培養(yǎng)數(shù)日并觀察生長情況。水保存法將真菌接種于培養(yǎng)基的斜面上，待培養(yǎng)成熟后，將無菌蒸偏水直接注入試管中沖洗下抱子和菌絲，再轉(zhuǎn)入無菌小試管中，密封瓶口，貼好標簽，存放在室溫或4℃即可。利用此管保存菌株，簡便易行，經(jīng)濟，效果好。在恢復(fù)培養(yǎng)時，取混懸液接種丁SDA培養(yǎng)基中即可。大多數(shù)真菌均可用這種方法保存數(shù)年（最長12年）。參考文獻1、周庭銀編著.臨床微生物學(xué)診斷與圖解.第二版.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,2007o2、中華人民共和國國務(wù)院令第424號.病原