淺論多糖生物膜在骨組織工程中應用的實驗研究【摘要】目的在骨組織工程的載體外包裹多糖生物膜(PSBM)，減少種子細胞在復合載體時的外溢逃出，驗證其在組織工程中應用的可行性。方法用全骨髓法獲得骨髓基質干細胞，體外擴增后，取第三代細胞種植于支架材料載體多孔納米磷灰石－硅灰石生物活性玻璃陶瓷/殼聚糖復合支架材料上，分2組，實驗組載體外用多糖生物膜物理包裹，對照組不包裹多糖生物膜，觀察載體外培養(yǎng)皿上的細胞生長數量；MTT檢測細胞活力；電鏡觀察載體上細胞粘附生長情況。結果實驗組培養(yǎng)板上載體外漏細胞較少，對照外漏細胞較多：MTT檢測兩組細胞活力差別無顯著性；電鏡觀察實驗組載體上細胞粘附生長較對照組稍優(yōu)。結論多糖生物膜在骨組織工程中具有應用前景。

【關鍵詞】多糖生物膜骨髓基質干細胞支架材料組織工程

Abstract:ObjectiveTopackbonetissueengineeringcarrierwithpolysaccharidebiomembranetodecreaseseed-cellsleaking,andtoauthenticatethefeasibilityofapplyingpolysaccharidebiomembraneinbonetissueengineering.MethodsBonemarrowstromalcellswerederivedthroughwhole-bone-marrowmethod,and,afteramplificationinvitro,thecellsofthethirdgenerationwereimplantedinA-W-MGC/CS.Thenthecellsweredividedintotwogroups-anexperimentalgroupwithcarrierpackedwithPSBMandacontrolgroupwithcarrierun-packed.Thenumberofcellgrowinginculturedishoutofthecarrierwasobserved，thestateofcellvigorwasdetectedwithMTT,andthestateofcelladhesionwasobservedwithelectronmicroscope.ResultsThenumberofleakingcellintheexperimentalgroupwaslessthanthatinthecontrolgroup.TheresultofMTTdetectionshowedthatdifferenceofcellvigorbetweentwogroupswasun-significant(P＜).Thegrowingstateofcellintheexperimentalgroupwasbetterthanthatinthecontrolgroupunderelectronmicroscope.ConclusionsPolysaccharidebiomembranehasanappliedprospectinBonetissueengineering.

Keywords：polysaccharidebiomembrane;bonemarrowstromalstemcell;bracketmaterial;tissueengineering

骨組織工程的核心是在體外培養(yǎng)細胞，然后將細胞種植到具有一定結構的三維支架上，再將這種細胞生物材料復合體植入骨缺損部位，通過生物過程使細胞長入多孔支架中，即經過細胞間相互粘附、增殖、分化，分泌細胞外基質最終形成具有一定結構和功能的組織或器官，從而達到骨修復的目的。細胞和支架材料的相互作用又起到關鍵的作用，減少細胞復合材料又未貼附在支架材料這段時間的外漏，可以有效的減少種子細胞的損失，增加細胞與支架材料之間的作用時間，更利于細胞粘附。由中國海洋大學生命學院研制的多糖生物膜是一種安全無毒，具有很好生物相容性的細胞培養(yǎng)移植載體。多糖生物膜是由殼聚糖衍生物、透明質酸及明膠按特定比例混合制成的膜型制劑。其分子量約為2000Da，透水率為10μL/。為了提高載體內外液體中大分子物質的流通，我們用顯微穿刺的方法在多糖生物膜上增加孔隙。耿燕、王曉莉［1，2］等將其應用于眼科的研究。本實驗研究將多糖生物膜應用于骨組織工程的可行性。

1材料與方法

實驗動物

2～3月齡清潔級日本大耳白兔1只，體重kg，由遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供。

實驗材料

多孔納米磷灰石－硅灰石生物活性璃玻陶瓷/殼聚糖復合支架材料，多糖生物膜，高糖DMEM，胎牛血清(北京華美)，Hepes,％胰酶，MTT，二甲基亞砜，96孔一次性培養(yǎng)板，CO2培養(yǎng)箱，倒置相差顯微鏡，JSM-5900LV掃描電鏡。

實驗方法

BMSCs的分離培養(yǎng)

取～2月齡的日本大耳白兔，雌雄不限，速眠新II(mL/kg)肌注麻醉，無菌條件下于脛骨上端抽取約4mL骨髓，在超凈工作臺上將骨髓加入無菌培養(yǎng)瓶中，再加入4mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(以下稱生長培養(yǎng)基)充分吹打，按每瓶2mL加入到30cm2的培養(yǎng)瓶中，補充2mL的生長培養(yǎng)液，放入37℃、5%CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5天后首次換液，以后每3天換液1次，在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。待貼壁細胞接近80%融合后，結束原代培養(yǎng)。吸去生長培養(yǎng)基，用無血清DMEM洗1次，加入%胰蛋白酶mL/瓶消化3～5分鐘，并在倒置顯微鏡下觀察消化效果。當有部分細胞脫壁、大部分細胞間隙變大時加入生長培養(yǎng)基mL/瓶終止消化。細胞沉淀用生長培養(yǎng)基吹打成單細胞懸液并按1∶3比例分裝傳代，以后每3d換液1次。

BMSCs復合A-W-MGC/CS及包裹多糖生物膜

將制作好的A-W-MGC/CS，孔徑在100～500μm，孔隙率為80%～90%，經環(huán)氧乙烷消毒后放置1個月，用前PBS沖洗3遍，用不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液浸泡置于37℃、5%CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱中7天，去掉培養(yǎng)液，在培養(yǎng)箱中自然晾干待用。將多糖生物膜修剪成5cm×3cm大小，浸泡于M的磷酸鹽緩沖液24小時，121℃高壓濕熱滅菌。手工將多糖生物膜從底面及側壁包裹晾干的A-W-MGC/CS復合支架材料可吸收線系好備用。取第三代BMSCs消化離心制成1×106的細胞懸液種植于實驗組包裹有經穿刺過的多糖生物膜的A-W-MGC/CS上，另一組細胞直接種植A-W-MGC/CS上，每組6塊，放入24孔培養(yǎng)板上，在37℃，5％CO2飽和濕度的孵箱中孵育。2h后翻面，4h后加入20％FBS的基礎培養(yǎng)液，每孔mL，培養(yǎng)7d，隔天更換培養(yǎng)液。

檢測項目

MTT值測定增值曲線的繪制

取第三代生長細胞種植于96孔培養(yǎng)板上，分2組，實驗組為浸泡有多糖生物膜的生長培養(yǎng)液，對照組為正常生長培養(yǎng)液。每板種植21個孔，每孔接種2×103個細胞，200μL培養(yǎng)液，每48小時換液。每日取3孔細胞，觀察細胞生長情況，加入20μLMTT，4h后盡量吸棄孔內培養(yǎng)液，加入150μL二甲基亞砜，振蕩10min，以490nm為測量波長，以空白孔為對照，用酶聯免疫檢測儀檢測各孔吸光度值【D】，根據MTT值繪制細胞增殖曲線。

倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)板上細胞外漏情況

24小時后取24孔培養(yǎng)板，在倒置顯微鏡下觀察支架材料外，培養(yǎng)板底外漏的細胞貼壁生長情況并細胞計數，細胞實際種植數=細胞種植總數-培養(yǎng)板底部外漏細胞數。種植率=細胞實際種植數／細胞種植總數×100%。

電鏡觀察支架材料上細胞貼附生長情況

將聯合培養(yǎng)7d的細胞與支架復合體標本分別取出后，PBS洗3次后，%戊二醛常溫下固定，60%～100%的乙醇梯度脫水，乙酸異戊酯置換。臨界點干燥，表面噴金，JSM-5900LV掃描電鏡分析。

統計學處理

采用軟件對數據進行分析，數據用±s表示，采用t檢驗進行組間比較，P＜時差異有統計學意義。

2結果

MTT實驗結果

根據每日不同D均值為數據，繪制細胞增殖曲線(見圖3)。結果顯示：浸泡有多糖生物膜的實驗組與對照組比較差異無統計學意義。說明細胞在浸泡有多糖生物膜的生長培養(yǎng)基的生長增殖不受影響。

倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)板上細胞外漏結果并計數細胞數

24小時后倒置顯微鏡下觀察放有支架材料的24孔培養(yǎng)板的底面并細胞計數，如圖4，圖5所示，可見實驗組外漏細胞較少，而對照則較多。

表124孔培養(yǎng)板的底面細胞計數

注：P＜,實驗組和對照組差異有統計學意義

實驗組細胞實際種植數為×105，種植率為88%；對照組細胞實際種植數為×105，種植率為53%。

電鏡觀察支架材料上細胞貼附生長情況

如圖6，圖7所示，可見細胞在支架材料上貼附生長良好，實驗組細胞呈不則球形，分布均勻，密度較大；對照組細胞分布不均勻，密度較少。

3討論

骨組織工程骨的體外構建要求最大限度的保證使用的種子細胞參與成骨,減少種子細胞的流失。在實驗中我們發(fā)現在細胞與載體復合時，細胞在載體內的滯留與粘附是至關重要的兩個方面。細胞與支架材料表面的接觸、黏附及相互作用是組織工程學的第一步。細胞必須與材料黏附［3］,才能進行遷移、分化和增殖。這種黏附作用在材料方面與材料的組成,親/疏水性,表面能拓撲結構及其表面的生物特異性活性功能集團等因素有關。為了提高細胞與支架材料間的黏附能力,對支架材料進行必要的改性是非常必要的。近年來，對各種支架材料表面的親和力，粘附作用的研究較多，大多數解決的都是細胞在載體上粘附的問題［4-6］。而細胞在載體上的滯留時間，不僅影響到種子細胞的流失和數量，更間接影響細胞與支架材料的粘附，因此增加細胞在載體上的滯留時間，可以有效的解決這個問題。

細胞在細胞接種至載體表面時，由于重力作用，細胞在載體中下沉從孔隙中溜出而不能有效的貼附。另外支架材料的側壁有較多的空隙，細胞可以從這些空隙中溜出。因此我們用多糖生物膜采用物理包裹的方法，將支架材料從底面及側壁包裹好，可以有效減少細胞的損失。

多糖生物膜有三個特性：其一是具有可通透性，即它具有半透膜性質水率10μL/min·cm2、分子量在2000Da的物質可自由通過）；其二，此膜對細胞有良好的粘著力，非常適合細胞的貼壁生長；其三，此膜可吸收。為了提高載體內外液體中大分子物質的流通，我們用顯微穿刺的方法在膜上增加孔隙。實驗中，我們用MTT法，檢測多糖生物膜對BMSCs的增殖及活性的影響，發(fā)現此膜有很好的生物相容性，不影響細胞的生長增殖，無細胞毒性。MTT比色法［7，8］，是一種檢測細胞存活和生長的方法，可間接反映活細胞數量,也是接觸法檢測材料細胞毒性的最常用的一種方法。在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。

實驗中，支架材料所在的培養(yǎng)板底外漏細胞的減少，實驗組細胞實際種植數較沒有包裹多糖生物膜的對照組高出35%，有效的減少種子細胞的損失；電鏡照片載體上細胞粘附情況，均反映了經過多糖生物膜包裹的支架材料上，細胞較長時間的滯留，可以增加細胞與支架材料的粘附，及其在上面生長增殖，并驗證了多糖生物膜在骨組織工程領域的作用。

【參考文獻】

［1］耿燕，楊朝忠.多糖生物膜細胞載體特性的實驗研究［J］.眼科研究，2003，21：501-504.

［2］王曉莉，李樹寧.多糖生物膜眼內生物相容性［J］.眼科新進展，2002，22:99-102.

［3］段智霞，鄭啟新.BMSCs在PLGA-【ASP-PEG】基質材料表面粘附及殖的研究［J］.中國生物工程雜志，2006，26：86-91.

［4］Sakiyama,ElbertSE,Hubbellal.Functionalbiomaterials；designofnovelbiomaterials［J］.AnnuRevMaterRes