干細(xì)胞的磁性標(biāo)記及肝內(nèi)活體磁共振示蹤【摘要】目的：探討超順磁性氧化鐵標(biāo)記骨髓干細(xì)胞的方法和標(biāo)記細(xì)胞在肝臟內(nèi)的磁共振活體成像特點(diǎn)和衰減規(guī)律.方法：分離培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，用SPIO標(biāo)記細(xì)胞并在超聲引導(dǎo)下局部注入兔肝臟內(nèi)，然后經(jīng)磁共振T1WI，T2WI和FFE序列進(jìn)行移植細(xì)胞團(tuán)的成像示蹤.結(jié)果：體外標(biāo)記的骨髓干細(xì)胞見黑色鐵顆粒位于細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，標(biāo)記后細(xì)胞的生長曲線與正常細(xì)胞一致.標(biāo)記的移植細(xì)胞團(tuán)在肝內(nèi)T1WI,T2WI和FFE序列上均呈低信號，以FFE圖像信號減低最為明顯并有面積增大效應(yīng).標(biāo)記細(xì)胞的信號減低區(qū)在T1WI,T2WI和FFE序列圖像上分別至注射后30,30和45d仍和注射前信號差異有統(tǒng)計學(xué)意義活體示蹤研究［2］.國內(nèi)的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究也開始起步［3-4］.我們采用超順磁性氧化鐵進(jìn)行兔活體內(nèi)肝干細(xì)胞的MRI示蹤研究，探討其在正常肝臟內(nèi)的成像特點(diǎn)和代謝規(guī)律等，為進(jìn)一步對肝功能不全模型進(jìn)行細(xì)胞移植研究奠定預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

1材料和方法

材料健康成年家兔11只，體質(zhì)量～kg，雌雄不拘，第四軍醫(yī)大學(xué)動物試驗(yàn)中心提供.隨機(jī)分為：①正常對照組1，肝臟內(nèi)注射未標(biāo)記的骨髓干細(xì)胞；②正常對照組2，肝臟內(nèi)注射SPIO；③標(biāo)記細(xì)胞組，肝臟內(nèi)注射標(biāo)記SPIO的MSCs.

細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM，胰蛋白酶，F(xiàn)BS，倒置顯微鏡，超凈工作臺CJ1S，CO2孵箱，分子天平，離心機(jī)802，熒光顯微鏡TE20005.ATL5000彩色多普勒超聲儀.SPIO注射液：mL/支，含鐵濃度mol/L，鐵顆粒直徑60nm.

方法

的分離、純化、培養(yǎng)用30g/L戊巴比妥鈉1mL/kg耳緣靜脈麻醉.無菌操作下，分別在雙側(cè)髂后上棘與髂骨平行，由內(nèi)上向外下穿入，每只抽取暗紅色骨髓約2～3mL.將抽取的骨髓加入到含5mLDMEM液的無菌離心管中，充分混勻.再把上述細(xì)胞懸液緩慢層加到含有4mL淋巴細(xì)胞分離液(比重為1077g/L)的無菌離心試管中,可見液體分層.常溫下2000r/min離心20min后，可見離心試管內(nèi)液體分為3層.收集中間云霧層的骨髓單個核細(xì)胞，加入到含4mLDMEM培養(yǎng)液的無菌離心管中，常溫下以1500r/min離心洗滌10min兩次后，傾去上清，然后用含肝細(xì)胞生長因子20mg/L的DMEM培養(yǎng)液混懸.將分離的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，然后以2×108/L密度接種于25mL培養(yǎng)瓶.接種后將培養(yǎng)瓶置于37℃，50mL/LCO2及飽和濕度的孵箱中培養(yǎng).72h后更換培養(yǎng)液，此后視細(xì)胞生長狀態(tài)每周換液2次.

的體外標(biāo)記和鐵濃度測定/標(biāo)記率測定原代的MSCs培養(yǎng)液8mL，含細(xì)胞量1×106，Revosite與之按1∶80的比率加入100μL，在37℃,50mL/LCO2條件下共同孵化過夜，24h后用PBS液清洗兩遍，然后加入g/L胰蛋白酶1～2mL，靜置2～3min，將胰蛋白酶傾倒，加入含100mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，用彎頭吸管反復(fù)吹打，使細(xì)胞完全脫落，制成細(xì)胞懸液，倒置顯微鏡下觀察并測量MSCs內(nèi)鐵粒子的標(biāo)記率.1000r/min離心洗滌5min獲得標(biāo)記MSCs，注射前以生理鹽水1mL將細(xì)胞重懸.

體外培養(yǎng)條件下MSCs的生長曲線將傳1代的MSCs制成細(xì)胞懸液，按照1×104個/孔的細(xì)胞密度接種于3個24孔板中，接種后每隔24h按順序檢測3個孔的細(xì)胞數(shù).

超聲引導(dǎo)下標(biāo)記細(xì)胞肝臟內(nèi)注射將兔腹腔內(nèi)麻醉后，固定于動物小型手術(shù)臺上，局部剪毛消毒，在超聲引導(dǎo)下將1mL注射器針頭進(jìn)針定位于肝臟左葉，推入注射器內(nèi)1mL標(biāo)記的MSCs溶液.

磁共振成像序列和方法術(shù)后即刻,1,3,7,10d,2,3wk分別行MR檢查.采用PhilipsGyroscanInteraMaster超導(dǎo)磁共振掃描儀，膝關(guān)節(jié)線圈，麻醉后俯臥位固定.掃描序列為T1WI/SE，T2WI/TSE，T2WI/FFE.

圖像分析與數(shù)據(jù)測量對比分析不同時間點(diǎn)標(biāo)記細(xì)胞低信號團(tuán)的大小變化，并測量注射前和注射后不同時間點(diǎn)肝臟靶區(qū)T1WI、T2WI和FFE序列上的信號強(qiáng)度，計算信號強(qiáng)度前后變化百分比［×100％］.

移植細(xì)胞的組織學(xué)檢查家兔耳緣靜脈注入10mL空氣處死，打開腹腔離體肝臟，取左葉注射點(diǎn)局部肝組織常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片交叉行HE染色和普魯士蘭染色.

統(tǒng)計學(xué)處理：對測量結(jié)果采用統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行多組間均數(shù)比較的方差分析，所有數(shù)據(jù)均表示為x±s.

2結(jié)果

的原代培養(yǎng)MSCs懸液接種后24h開始有細(xì)胞貼壁，且搖晃瓶身貼壁細(xì)胞不易脫落.初期的貼壁細(xì)胞多為球形或短梭形，72h完全換液后可見貼壁細(xì)胞分裂增殖(圖1)，用圖像分析儀在顯微鏡下隨機(jī)測量20個細(xì)胞的直徑，平均為40μm.培養(yǎng)5～7d后細(xì)胞分裂增殖明顯，出現(xiàn)形態(tài)均一的細(xì)胞增殖集落，形態(tài)也漸變?yōu)殚L梭形，約8～12d貼壁生長的細(xì)胞即可融合形成單層.

圖1兔骨髓干細(xì)胞培養(yǎng)72h×400略

的體外標(biāo)記觀察及標(biāo)記率測定孵化過夜后倒置顯微鏡觀察所有細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)均可見或多或少的黑色鐵顆粒，多的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)全為黑色，少的則為散在細(xì)沙樣黑顆粒，隨機(jī)鏡下觀察10個高倍鏡視野均是如此，標(biāo)記率基本達(dá)到100%.隨時間生長曲線呈上升趨勢.

圖2標(biāo)記后的兔骨髓干細(xì)胞×400略

圖3兔骨髓干細(xì)胞生長曲線略

超聲引導(dǎo)下定位注射點(diǎn)在超聲引導(dǎo)下可明確觀察到針頭定位于肝臟左葉，并可見注入的高回聲標(biāo)記MSCs溶液團(tuán).

細(xì)胞移植后MRI活體內(nèi)示蹤正常對照組1未標(biāo)記的MSCs注入肝臟左葉后MRI均未顯示；正常對照組2注射單純SPIO后24h內(nèi)均顯示信號減低團(tuán)，但24h后即顯示不明顯，72h后則完全不顯示；標(biāo)記SPIO的干細(xì)胞注射組：MRI各個掃描序列T1WI,T2WI和FFE上均可見肝臟左葉標(biāo)記細(xì)胞注射區(qū)域的信號減低，以FFE信號減低最為顯著且有靶區(qū)面積增大效應(yīng).同時間點(diǎn)不同序列靶區(qū)信號減低大小不盡相同，F(xiàn)FE＞T2WI＞T1WI，不同時間點(diǎn)同一序列靶區(qū)逐漸變小，T1WI和T2WI改變較為一致，F(xiàn)FE靶區(qū)減小緩慢.所測肝臟和標(biāo)記細(xì)胞注射區(qū)域T1WI,T2WI相上的不同信號強(qiáng)度見表1.T1WI圖像SPIO注射前與注射后直到30d靶區(qū)信號強(qiáng)度差異有統(tǒng)計學(xué)意義攝取后可引起局部磁場不均勻造成鄰近質(zhì)子自旋快速失相位而縮短組織T2時間，從而大大降低靶病灶T2WI圖像的信號強(qiáng)度而使其特異性顯示.因此，注入的標(biāo)記干細(xì)胞團(tuán)因含鐵顆粒而顯示為低信號，也就間接反映了移植細(xì)胞的分布和聚集情況.

在體外，由于細(xì)胞膜和氧化鐵顆粒都帶有負(fù)電荷，所以未經(jīng)修飾的氧化鐵無法有效標(biāo)記干細(xì)胞.目前多采用帶正電荷的轉(zhuǎn)染劑如多聚賴氨酸PLL［6］、硫酸魚精蛋白、繁枝體等，通過靜電荷作用包裹氧化鐵顆粒，使帶負(fù)電荷的細(xì)胞通過非特異性膜表面吸收過程攝取鐵顆粒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi).這樣移植細(xì)胞的氧化鐵顆粒標(biāo)記就變得非常簡單，只需將分離、純化的移植細(xì)胞放入一定濃度修飾后的鐵溶液經(jīng)體外孵化過夜24h，含鐵顆粒即可進(jìn)入移植細(xì)胞內(nèi)，標(biāo)記率可達(dá)到99％［7］.我們采用的SPIO為羧基右旋糖苷包裹的氧化鐵納米顆粒成品制劑，標(biāo)記率達(dá)到100％.SPIO作為標(biāo)記移植細(xì)胞的對比劑被證實(shí)不同的濃度對細(xì)胞的生存能力、功能均無不利影響，亦無毒性［8］.Himes等［9］對標(biāo)記的心肌干細(xì)胞體外觀察第14日仍然具有和未標(biāo)記細(xì)胞相似的活性.我們對標(biāo)記細(xì)胞的體外生長曲線圖也證實(shí)SPIO允許細(xì)胞保持其生物活性和正常的增殖能力.但對鼠干細(xì)胞的成像實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，當(dāng)標(biāo)記率大于100gFe/L干細(xì)胞培養(yǎng)液時，肝細(xì)胞的增殖能力即被充分限制，一般應(yīng)用劑量應(yīng)小于50gFe/L移植細(xì)胞培養(yǎng)液［10］.

研究證實(shí)未標(biāo)記的SPIO24h后即不再顯示明確的低信號，說明細(xì)胞外的SPIO在器官內(nèi)存留時間較短.本實(shí)驗(yàn)正常對照組2注射未標(biāo)記的SPIO后MRI成像觀察結(jié)果也與此一致.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示注入的標(biāo)記細(xì)胞團(tuán)隨著時間的推移成像面積逐漸減小，信號減低強(qiáng)度也呈逐步減弱趨勢.由于標(biāo)記細(xì)胞經(jīng)組織學(xué)證實(shí)局部存活，因此信號的減低可以認(rèn)為主要是由于鐵顆粒的排出引起的.我們采用氧化鐵納米顆粒，在肝臟的成像時間持續(xù)至注射后45d，說明了納米鐵顆粒在肝臟內(nèi)的保持力較長.

SPIO的順磁性可以使MRI的T1WI,T2WI和FFE圖像的靶區(qū)信號均明顯降低，產(chǎn)生負(fù)性對比劑的效應(yīng).Kustermann等［11］對比了注射標(biāo)記細(xì)胞前信號衰減的心梗區(qū)在質(zhì)子密度加權(quán)圖像和T2*WI圖像上的大小是一樣的，但注射標(biāo)記鐵顆粒的細(xì)胞后T2*WI圖像上的心梗信號衰減區(qū)域則大于質(zhì)子密度加權(quán)圖像的心梗信號衰減區(qū)，說明T2*WI對SPIO最為敏感，其信號減低效應(yīng)可增大靶區(qū)面積.這在我們的實(shí)驗(yàn)中也得到了證實(shí).注射后每次進(jìn)行的3個序列的成像圖均顯示FFE靶區(qū)面積最大，其次為T2WI和T1WI圖像；另外當(dāng)標(biāo)記的移植細(xì)胞團(tuán)低信號區(qū)于注射后3,7d開始減小時，相應(yīng)的FFE圖像該靶區(qū)低信號改變?nèi)匀皇置黠@，減小的趨勢也緩慢，同樣說明FFE對SPIO最為敏感.

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示SPIO可簡便、有效地標(biāo)記MSCs，并進(jìn)行活體內(nèi)肝臟移植細(xì)胞的MRI示蹤成像研究，標(biāo)記的肝干細(xì)胞在體內(nèi)存留時間長達(dá)1mo以上，可滿足長期動態(tài)的隨訪和療效觀察，對進(jìn)一步的動物實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用研究具有重要指導(dǎo)意義.

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