實(shí)驗(yàn)九動(dòng)物骨髓細(xì)胞染色體的制備《細(xì)胞與顯微技術(shù)實(shí)驗(yàn)》了解制備中期染色體標(biāo)本的原理掌握動(dòng)物骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備技術(shù)觀察染色體的數(shù)目以及形態(tài)特征一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵笤谡?dòng)物細(xì)胞中，骨髓是處于不斷分裂的組織之一，骨髓細(xì)胞中的造血干細(xì)胞是生成各種血細(xì)胞和原始細(xì)胞，具有高度的分裂活性并且數(shù)量非常多。處于分裂期的細(xì)胞經(jīng)秋水仙素或秋水酰胺處理后，由于阻斷了紡錘絲微管的組裝，使分裂細(xì)胞阻斷在有絲分裂中期，此時(shí)染色體達(dá)到最大收縮，具有典型的形態(tài)，再經(jīng)離心、低滲處理及固定、滴片、染色等步驟，便可制作較好的骨髓細(xì)胞的染色體標(biāo)本。二、實(shí)驗(yàn)原理三、實(shí)驗(yàn)用品材料

牛蛙。2.器具:解剖器具、注射器(2mL)、離心機(jī)、刻度離心管、玻璃吸管、載玻片、蓋玻片、顯微鏡、恒溫水浴鍋等。3.試劑:

2mg/ml

秋水仙素溶液、固定液(甲醇：冰醋酸＝3：1)、0.075mol/L的KCl低滲溶液、Giemsa染液、磷酸緩沖液(pH7.2)、0.85%生理鹽水等。

1、秋水仙素處理：實(shí)驗(yàn)前一天晚上，按照青蛙每克體重4ug的劑量，腹腔注射秋水仙素。2、取股骨：將牛蛙處死，迅速取出股骨（為了獲得較多的骨髓細(xì)胞脛骨亦可使用），用剪刀和紗布剝?nèi)ト考∪饨M織，用骨剪剪開長骨兩端的膨大部半透明軟骨（不能全部剪斷），程度以剛剛露出紅色的骨髓組織為宜。收集前后肢提取6根骨頭（每組3根）。四、實(shí)驗(yàn)步驟每組同學(xué)取前肢、后肢各一，獲取長骨3根上肢1下肢23、取骨髓：用2mL注射器吸取生理鹽水2mL，將針頭插入骨髓腔，將紅骨髓細(xì)胞沖入35mm培養(yǎng)皿內(nèi)，反復(fù)幾次，直至骨頭變白（需將隨骨髓沖出物中大塊白色脂肪組織用鑷子挑出），將一只牛蛙的所有骨髓細(xì)胞集中在一只離心管中，吸打骨髓細(xì)胞，使細(xì)胞團(tuán)塊分散。四、實(shí)驗(yàn)步驟注意：沖洗時(shí)動(dòng)作要徐緩，以免溶液噴出，損失骨髓細(xì)胞4、將骨髓細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入2只1.5mL離心管中（等體積，保證離心平衡），以1500rpm離心10min，棄去上清液.5、低滲：每管加入0.5mLKCL溶液，吸打混合均勻，將兩管合并成一管，37℃水浴低滲25min。（細(xì)胞膨脹，使滴片時(shí)細(xì)胞膜破碎，染色體分散）6、固定：將低滲處理后的細(xì)胞懸液2000rpm離心6min，小心吸去上清液（棄去）,每管加入新鮮配置的甲醇：冰醋酸（3：1）1mL，用移液器將細(xì)胞輕輕吸打均勻，固定15

min。（固定細(xì)胞形態(tài)，阻止染色體收縮，使染色體結(jié)構(gòu)免于破壞）7、重復(fù)上面步驟一次。8、2000rpm離心6min，小心吸去上清液（每管約900μL），留少量殘液用吹打法將沉淀制備成細(xì)胞懸液。9、滴片：在預(yù)先冷凍，用酒精浸泡的載玻片上，滴加1-3滴上層細(xì)胞懸液，在烘箱中烘干。10、染色：將玻片平放于支架上，細(xì)胞面向上，每片滴加Giemsa染液數(shù)滴，染色10~20min。11、鏡檢：在自來水管下沖洗數(shù)秒，去掉染液，在烘箱中烘干，滴加甘油后蓋上蓋玻片，顯微鏡觀察。四、實(shí)驗(yàn)步驟滴片的制作0.5~1m首先在10倍鏡下觀察標(biāo)本，應(yīng)背景清晰，雜質(zhì)較少，細(xì)胞分散良好。10倍鏡下找到松散的細(xì)胞團(tuán)，類似于線團(tuán)，其染色比較致密的細(xì)胞核顏色淺。轉(zhuǎn)到40倍鏡下，應(yīng)能看到成X型的中期染色體，如分散較好的圖像可以看清結(jié)構(gòu)并數(shù)清其條數(shù)。在40倍鏡下找到清晰圖像后，可直接拍照保存，并記錄下該圖像大致位置(載物臺(tái)上標(biāo)本移動(dòng)軸上對(duì)應(yīng)位置)。在40倍鏡下將圖像移至視野正中央，再下降載物臺(tái)，滴香柏油轉(zhuǎn)油鏡觀察圖像，拍照保存。觀察完畢立即清理油鏡鏡頭!

注意滴了油的載玻片不能在40倍鏡下觀察!鏡檢觀察五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果優(yōu)良制片標(biāo)準(zhǔn):單個(gè)細(xì)胞的染色體較集中，各染色體分散均勻且互不重疊，染色體長度適中，呈藍(lán)紫色，能清晰顯示著絲點(diǎn)位置。牛蛙染色體2n=26牛蛙骨髓細(xì)胞染色體核型（2n=26）1、低滲與離心等步驟的操作要輕。2、低滲處理極為重要，其目的是使細(xì)胞體積脹大，染色體松散。低滲不夠，則染色體聚在一起，分散不好。太過，則造成細(xì)胞破碎，染色體丟失。3、固定液要現(xiàn)配現(xiàn)用，固定徹底后再打散細(xì)胞團(tuán)塊，否則細(xì)胞容易破碎，染色體分散亦收到影響。4、載玻片要預(yù)冷，冷卻不夠，則會(huì)影響染色體的附著和鋪展