第十章生物制品一、生物制品概述二、疫苗研究及其研制策略三、生物制品的一般制造方法、質(zhì)量要求與檢定四、重要生物制品的制備五、核酸疫苗第一節(jié)：生物制品概述1概念及發(fā)展沿革2生物制品的分類(lèi)3制造生物制品的生物學(xué)及免疫學(xué)基礎(chǔ)1概念及發(fā)展沿革1.1概念凡是從微生物及其代謝產(chǎn)物、原蟲(chóng)、動(dòng)物毒素、人或動(dòng)物的血液或組織直接加工制成，或用現(xiàn)代生物技術(shù)、化學(xué)方法制成，作為預(yù)防、治療、診斷特定傳染病或其他有關(guān)疾病的免疫制劑。包括各種疫苗、抗血清、抗毒素、類(lèi)毒素、免疫調(diào)節(jié)劑、診斷試劑等。1.2從疫苗生產(chǎn)看生物制品的發(fā)展12世紀(jì)，中國(guó)開(kāi)始用人痘接種預(yù)防天花，從癥狀輕微的天花病人身上人工接染到健康兒童，使其通過(guò)產(chǎn)生輕微癥狀的感染獲得免疫力，避免天花引起的嚴(yán)重疾病甚至死亡。1721年，人痘接種法傳入英國(guó)，英國(guó)醫(yī)生琴納注意到感染過(guò)牛痘的人不會(huì)再感染天花。經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)，琴納于1796年從一擠奶女工感染的痘皰中，取出皰漿，接種于8歲男孩的手臂上，然后讓其接種天花膿皰液，結(jié)果該男孩并未染上天花，證明其對(duì)天花確實(shí)具有了免疫力。最早的弱毒活病毒疫苗。1.2從疫苗生產(chǎn)看生物制品的發(fā)展1798年，醫(yī)學(xué)界正式承認(rèn)“疫苗接種確實(shí)是一種行之有效的免疫方法”。經(jīng)過(guò)一百多年的努力，1980年世界衛(wèi)生組織宣布全球消滅了天花。1870年，法國(guó)科學(xué)家巴斯德發(fā)明了第一個(gè)細(xì)菌減毒活疫苗——雞霍亂疫苗。巴斯德將此歸納為對(duì)動(dòng)物接種什么細(xì)菌就可以使其不受該病菌感染的免疫接種原理，從而奠定了疫苗的理論基礎(chǔ)。因此人們把巴斯德稱(chēng)為疫苗之父。1.2從疫苗生產(chǎn)看生物制品的發(fā)展第二代疫苗——亞基疫苗的出現(xiàn)，克服了第一代疫苗潛在致病性的問(wèn)題。天然或重組成分為主。第三代疫苗——核酸疫苗，調(diào)動(dòng)細(xì)胞免疫和體液免疫兩個(gè)系統(tǒng)，追求最佳效果。持久，廣譜，廉價(jià)。返回目錄2生物制品的分類(lèi)1.疫苗等預(yù)防類(lèi)生物制品：細(xì)菌類(lèi)疫苗、病毒類(lèi)疫苗、類(lèi)毒素和聯(lián)合疫苗。2.抗毒素及免疫血清：由特定抗原免疫動(dòng)物所得血漿制成的抗毒素或免疫血清，如破傷風(fēng)抗毒素、抗狂犬病血清等，用于治療或被動(dòng)免疫預(yù)防。3.血液制品：如人血白蛋白、人免疫球蛋白、人凝血因子（天然或重組的）、紅細(xì)胞濃縮物等。4.診斷制品：包括體內(nèi)診斷制品和體外診斷制品。返回目錄3制造生物制品的生物學(xué)及免疫學(xué)基礎(chǔ)3.1生物學(xué)基礎(chǔ)A:細(xì)菌的代謝產(chǎn)物。(1)熱原質(zhì)主要是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的脂多糖，注入體內(nèi)能引起發(fā)熱反應(yīng)。(2)毒素有內(nèi)毒素和外毒素兩種，均有強(qiáng)烈毒性。(3)色素許多細(xì)菌能產(chǎn)生色素，對(duì)其鑒別有用。B:外界環(huán)境因素對(duì)微生物的影響一方面可創(chuàng)造有利條件，促進(jìn)它們的生長(zhǎng)繁殖，以制備生物制品；另一方面也可利用對(duì)微生物不利的因素使其發(fā)生變異或殺滅之，以更好地為制造生物制品服務(wù)。常用的幾個(gè)概念：消毒；滅菌；無(wú)菌；防腐。3.2免疫學(xué)基礎(chǔ)3.2.1機(jī)體的抗感染免疫

1)先天性免疫（非特異性免疫）包括：①體表屏障，如皮膚粘膜屏障；②血腦屏障，防御病原微生物及其毒性產(chǎn)物從血流侵入腦組織；③細(xì)胞吞噬作用；④正常體液和組織中的抗菌物質(zhì)。2)特異性免疫：個(gè)體在生命過(guò)程中接受抗原刺激后主動(dòng)產(chǎn)生或被動(dòng)獲得的。又稱(chēng)獲得性免疫。

包括自動(dòng)免疫和被動(dòng)免疫。人工免疫人為的給機(jī)體輸入抗原以調(diào)動(dòng)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，或直接輸入免疫血清，使獲得某種特殊抵抗力，用以預(yù)防或治療某些疾病者，稱(chēng)人工免疫。人工主動(dòng)免疫(artificialactiveimmunization)：是指給機(jī)體接種抗原性物質(zhì)如疫苗，類(lèi)毒素等，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性免疫力的方法。3.2.2人工免疫人工被動(dòng)免疫(artificialpassiveimmunization):

是給人體注射含特異性抗體的免疫血清或細(xì)胞因子等制劑，使受者迅速獲得特異性免疫力的方法。3.3人工自動(dòng)免疫類(lèi)生物制品疫苗（Vaccine）：細(xì)菌，病毒，螺旋體，立克次體和類(lèi)毒素等抗原性生物制品統(tǒng)稱(chēng)為疫苗。

安全有效實(shí)用分類(lèi)1）死疫苗（deathvaccine）:選用免疫原性強(qiáng)的微生物標(biāo)準(zhǔn)株經(jīng)大量培養(yǎng)后，用物理或化學(xué)方法將其殺死或滅活而制成的預(yù)防制劑。如霍亂、百日咳、傷寒、鉤端螺旋體疫苗。優(yōu)點(diǎn)：主要誘導(dǎo)特異性抗體產(chǎn)生，安全缺點(diǎn)：不能繁殖，需多次刺激，注射局部和全身反應(yīng)嚴(yán)重2）減毒活疫苗（live-attenuatedVaccine）用人工定向變異或從自然界篩選得到的毒力高度減弱或基本無(wú)毒的病原微生物制成的預(yù)防制劑。優(yōu)點(diǎn)：一次免疫即可獲得長(zhǎng)久免疫力，類(lèi)似自然狀態(tài)下的輕型或隱性感染。誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫。缺點(diǎn)：不易保存，存在回復(fù)突變的危險(xiǎn)如卡介苗牛痘麻疹等3）類(lèi)毒素（Toxid）細(xì)菌外毒素經(jīng)0.3-0.4%甲醛處理，使其毒性減弱而保留其免疫原性。白百破：白喉類(lèi)毒素+百日咳桿菌死疫苗+破傷風(fēng)類(lèi)毒素4）新型疫苗（1）亞單位疫苗（SubunitVaccine）是去除病原體中與激發(fā)保護(hù)性免疫無(wú)關(guān)的甚至有害的成分，保留有效免疫原成分制作的疫苗。優(yōu)點(diǎn)：免疫效果高，不良反應(yīng)少（2）合成肽疫苗

(syntheticpeptidevaccine)

將具有保護(hù)性免疫力的人工合成肽與適當(dāng)載體結(jié)合后，再加入佐劑制成的疫苗。乙肝病毒多肽疫苗（3）基因工程疫苗DNA疫苗（DNAVaccine）是用編碼病原體有效免疫原的基因與細(xì)菌質(zhì)粒構(gòu)建的重組體直接免疫機(jī)體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，使其表達(dá)保護(hù)性抗原，從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫的疫苗。優(yōu)點(diǎn)：體內(nèi)可持續(xù)表達(dá)，免疫效果好，維持時(shí)間長(zhǎng)。缺點(diǎn)：其機(jī)制和安全性尚不完全清楚，一些問(wèn)題有待解決。重組抗原疫苗(recombinantantigenvaccine)

是利用DNA重組技術(shù)制備的只含保護(hù)性抗原的純化疫苗。優(yōu)點(diǎn)：不含活的病原體和病毒核酸，安全有效，成本低廉。目前獲準(zhǔn)使用的有乙型肝炎疫苗。重組載體疫苗(recombinantvectorvaccine)

是將編碼病原體有效免疫原的基因插入載體（減毒的病毒或細(xì)菌疫苗株）基因組中，接種后，隨疫苗株在體內(nèi)的增殖，大量所需的抗原得以表達(dá)。如果將多種病原體的有關(guān)基因插入載體，則成為可表達(dá)多種保護(hù)性抗原的多價(jià)疫苗。載體：痘苗病毒轉(zhuǎn)基因植物疫苗用轉(zhuǎn)基因方法，將編碼有效免疫原的基因?qū)肟墒秤弥参锛?xì)胞的基因組中，免疫原即可在植物的可食用部分穩(wěn)定的表達(dá)和積累，人類(lèi)和動(dòng)物通過(guò)攝食達(dá)到免疫接種的目的。常用的植物有蕃茄、馬鈴薯、香蕉等。（一）特異性免疫治療劑1）抗毒素

利用類(lèi)病毒注射動(dòng)物，產(chǎn)生特異性抗體，經(jīng)采血、分離、純化后制成的產(chǎn)品。2）抗病毒血清

用病毒作抗原免疫動(dòng)物制備的含有抗體的血清生物制品。3.4人工被動(dòng)免疫類(lèi)生物制品還有：抗菌血清、免疫球蛋白、免疫核糖核酸等（二）非特異性免疫治療劑---免疫調(diào)節(jié)劑1）轉(zhuǎn)移因子2）白細(xì)胞介素6）小棒桿菌3）胸腺素4）細(xì)胞毒T細(xì)胞5）卡介苗7）干擾素返回目錄第二節(jié)疫苗疫苗的現(xiàn)代定義為：一切通過(guò)注射或黏膜途徑接種，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)特定致病原的特異性抗體或細(xì)胞免疫，從而使機(jī)體獲得保護(hù)或消滅該致病原能力的生物制品統(tǒng)稱(chēng)為疫苗，包括蛋白質(zhì)、多糖、核酸、活載體或感染因子。預(yù)防用生物制品按所用材料一般分細(xì)菌類(lèi)及其類(lèi)毒素類(lèi)疫苗、病毒類(lèi)疫苗、蛋白疫苗和核酸疫苗四大類(lèi)。1接種目的及作用接種目的防止病原體進(jìn)入機(jī)體建立抗感染免疫口服或注射疫苗

激發(fā)宿主產(chǎn)生抗病原體的抗體暴露于病原體也不會(huì)生病進(jìn)入機(jī)體的病原體被抗體失活2疫苗的種類(lèi)從疫苗研制技術(shù)又可將疫苗分為傳統(tǒng)疫苗和新型疫苗兩大類(lèi)。2.1常規(guī)疫苗1）疫苗（1）活疫苗：減毒活疫苗（卡介苗）（2）死疫苗（百日咳、霍亂等）2）類(lèi)毒素破傷風(fēng)類(lèi)毒素、白喉類(lèi)毒素3）自身疫苗由病人自身病灶中分離出的病原體制成的死疫苗。返回目錄2.2新型疫苗1）亞單位疫苗一類(lèi)保留病原體中有效免疫原成分，而除去無(wú)效成分和有毒成分的化學(xué)純疫苗。

乙肝亞單位疫苗2）化學(xué)疫苗用化學(xué)方法提取病原體中有效免疫原成分體制成的化學(xué)純疫苗，比亞單位疫苗更為簡(jiǎn)單。

肺炎鏈球菌莢膜多糖3）多肽疫苗人工合成的高免疫原性多肽片段制成的疫苗。

乙型肝炎表面抗原的各種合成肽段4）基因工程疫苗利用基因工程構(gòu)建重組基因序列，表達(dá)免疫原性強(qiáng)、無(wú)毒性的多肽制成的疫苗。

乙型肝炎基因工程疫苗5）DNA疫苗用編碼抗原基因制成的疫苗。

流感病毒核蛋白DNA疫苗通常也習(xí)慣地將遺傳重組疫苗、合成肽疫苗和抗獨(dú)特型抗體疫苗包括在新型疫苗范疇。

3疫苗的基本成分、性質(zhì)和特征3.1疫苗的基本成分

疫苗的基本成分包括抗原、佐劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、滅活劑及其他活性成分。

抗原，是疫苗最主要的有效活性成分，它決定了疫苗的特異免疫原性。構(gòu)成抗原的三個(gè)基本條件：異物性、特異性和一定的理化特性?？捎米骺乖纳锘钚晕镔|(zhì)有：滅活病毒或細(xì)菌、活病毒或細(xì)菌通過(guò)實(shí)驗(yàn)室多次傳代得到的減毒株、病毒或菌體提純物、有效蛋白成分、類(lèi)毒素、細(xì)菌多糖、合成多肽以及近年來(lái)發(fā)展DNA疫苗所用的核酸等。佐劑，能增強(qiáng)抗原的特異性免疫應(yīng)答。目前常用的有鋁佐劑和油制佐劑。3.2疫苗的基本性質(zhì)

包括免疫原性、安全性、穩(wěn)定性。免疫原性：指疫苗接種進(jìn)入機(jī)體后引起機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。影響的因素包括機(jī)體的因素和疫苗的因素。從疫苗的角度看是由疫苗的抗原決定的。包括抗原的強(qiáng)弱、大小和穩(wěn)定性以及抗原的理化性質(zhì)。4疫苗制備的基本過(guò)程疫苗因種類(lèi)不同，其制備方法也不相同，但總的來(lái)說(shuō)，經(jīng)典疫苗制備的基本過(guò)程包括：選擇適宜的培養(yǎng)基或細(xì)胞，進(jìn)行菌、毒株大量繁殖，收集培養(yǎng)物，提純，半成品檢定，稀釋?zhuān)盅b，成品檢定。二、病毒類(lèi)疫苗制造方法

疫苗制備工藝各異，但主要程序一致。疫苗制備工藝流程1、毒種的選擇和減毒毒株必須滿(mǎn)足的條件具有特定抗原性：能使機(jī)體誘發(fā)特定的免疫力足以阻止有關(guān)的病原體的侵入或防止機(jī)體發(fā)生相應(yīng)的疾病。具有典型形態(tài)，感染特定組織的特性，并在傳代過(guò)程中能長(zhǎng)期保持生物學(xué)特性。毒株易在特定的組織中大量繁殖。人工繁殖，不產(chǎn)生毒素?zé)o毒力回復(fù)不被病毒感染2病毒繁殖（1）活體動(dòng)物培養(yǎng)：將病毒接種動(dòng)物的鼻腔、腹腔、腦腔或皮下繁殖。如：牛痘牛皮下，乙腦鼠腦等。生產(chǎn)中已淘汰。（2）雞胚培養(yǎng)：接種到7～14d幼齡雞胚的尿囊腔、卵黃囊或絨毛尿囊膜處繁殖。較動(dòng)物管理方便。易受支原體，沙門(mén)菌污染。（3）組織培養(yǎng)。廣泛用于病毒培養(yǎng)。（4）細(xì)胞培養(yǎng)。3、細(xì)胞培養(yǎng)條件維持細(xì)胞培養(yǎng)所需的最佳條件在大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的過(guò)程中，最根本的是使細(xì)胞的培養(yǎng)條件達(dá)到最優(yōu)化，盡可能消除或減輕環(huán)境對(duì)細(xì)胞的影響，維持細(xì)胞高存活力和高效表達(dá)，同時(shí)又要充分考慮細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物的后續(xù)純化。配制細(xì)胞生長(zhǎng)最適合的培養(yǎng)基

常用維持液和生長(zhǎng)液

Eagle、RPM1640,DEME等作為維持液，加入牛血清為生長(zhǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境

影響細(xì)胞培養(yǎng)的主要因素有:CO2、溶氧(DO)、溫度、pH值、葡萄糖、氨、乳酸、甲基乙二醛(MG)、培養(yǎng)基成分等。細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境最適CO2水平為4%～10%，溶氧維持在20%～50%，溫度大多數(shù)在37℃，pH值在7.0～7.4之間?？刂萍?xì)菌污染，加入青霉素、鏈霉素培養(yǎng)時(shí)間2－4天。培養(yǎng)容器內(nèi)壁潔凈度。葡萄糖是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中主要的能量來(lái)源，必須維持在一定水平。3疫苗的滅活原則：充分破壞疫苗的毒力，盡量減少疫苗免疫力損失。0.2％－0.4％的甲醛或酚溶液。4疫苗的純化去除存在的動(dòng)物組織，降低接種不良反應(yīng)。5凍干升華，不使疫苗融解。疫苗穩(wěn)定性提高1倍以上。三、細(xì)菌類(lèi)疫苗和類(lèi)毒素的一般制造方法細(xì)菌類(lèi)疫苗和類(lèi)毒素均由細(xì)菌培養(yǎng)開(kāi)始，制備的主要程序相似。細(xì)菌類(lèi)疫苗對(duì)菌體進(jìn)一步加工類(lèi)毒素對(duì)細(xì)菌分泌的外毒素加工疫苗和類(lèi)毒素制備工藝流程1菌種的選擇抗原性典型形態(tài)，培養(yǎng)特性和理化特性易于在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)，不產(chǎn)生毒素培養(yǎng)過(guò)程中毒性?。ㄋ谰呙纾┗驘o(wú)毒力回復(fù)（活菌疫苗）制備毒素時(shí)需培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生大量的典型毒素2培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)要求碳、氮源和無(wú)機(jī)鹽等必需外，有時(shí)需添加生長(zhǎng)因子。結(jié)核桿菌以甘油為碳源，百日咳桿菌需要谷氨酸，胱氨酸為氮源。3培養(yǎng)條件控制氧分壓、溫度、pH、避光、滲透壓等4殺菌徹底殺死細(xì)菌不影響防病效力5稀釋、分裝和凍干含防腐劑的NS稀釋?zhuān)瑹o(wú)菌分裝。四、生物制品質(zhì)量要求與檢定生物制品質(zhì)量的特殊重要性所有預(yù)防制品都是直接用于大量健康人群（兒童）所用治療制品都是通過(guò)非胃腸途徑直接用于患者診斷試劑，其質(zhì)量則關(guān)系到能否對(duì)患者或試樣做出特異、敏感的正確診斷和分析生物制品的質(zhì)量安全性有效性可接受性生物制品的GMP管理《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》GMP（GoodManufacturingPracticesforDrugs）：是對(duì)生物制品生產(chǎn)全過(guò)程的質(zhì)量管理，涉及人員、廠房和設(shè)備、原料采購(gòu)入庫(kù)、檢驗(yàn)、發(fā)料，加工，在制品及半成品檢驗(yàn)，分包裝，成品檢定，出品銷(xiāo)售，運(yùn)輸，用戶(hù)意見(jiàn)及使用反應(yīng)處理等在內(nèi)的全過(guò)程的質(zhì)量管理。主要包括以下三個(gè)方面：人員、廠房和設(shè)備和原材料（硬件）、管理制度和要求（軟件）

1生物制品的標(biāo)準(zhǔn)化1.1生物制品規(guī)程《中國(guó)生物制品規(guī)程》是我國(guó)生物制品生產(chǎn)、檢定、經(jīng)營(yíng)和使用的技術(shù)法規(guī)，是監(jiān)督檢驗(yàn)生物制品質(zhì)量的法定標(biāo)準(zhǔn)。

1.2生物制品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定義：系指用于生物制品效價(jià)、活性或含量測(cè)定的或其特性鑒別、檢查的生物標(biāo)準(zhǔn)品或生物參考物質(zhì)。國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品，由WHO制備、審定和分發(fā)國(guó)家生物標(biāo)準(zhǔn)品，由國(guó)家鑒定機(jī)構(gòu)制備、審定和分發(fā)種類(lèi)：國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品國(guó)際參考品國(guó)際生物參考試劑種類(lèi)：國(guó)家生物標(biāo)準(zhǔn)品國(guó)家生物參考品國(guó)家生物參考試劑3.1生物制品的標(biāo)準(zhǔn)化3.1.2生物制品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)種類(lèi)國(guó)家生物標(biāo)準(zhǔn)品國(guó)家生物參考品國(guó)家生物標(biāo)準(zhǔn)品，系指用國(guó)際生物標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定的，或由我國(guó)自行研制的（尚無(wú)國(guó)際生物標(biāo)準(zhǔn)品者）用于定量測(cè)定某一制品效價(jià)或毒性的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其生物學(xué)活性以國(guó)際單位（IU）或以單位（U）表示。國(guó)家生物參考品，系指用國(guó)際生物參考品標(biāo)定的，或由我國(guó)自行研制的（尚無(wú)國(guó)際生物標(biāo)準(zhǔn)品者）用于微生物（或其產(chǎn)物）的定性鑒定或疾病診斷的生物試劑、生物材料或特異性抗血清；或指用于定量檢測(cè)某些制品的生物效價(jià)的參考物質(zhì)，其效價(jià)以特定活性單位表示，不以國(guó)際單位表示。3.1.2生物制品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備和標(biāo)定國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品由中國(guó)藥品生物制品檢定所（下稱(chēng)檢定所）負(fù)責(zé)制備（或委托其他單位制備）、檢定、初步標(biāo)定、組織協(xié)作標(biāo)定及供應(yīng)。國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品、參考品及參考試劑由檢定所向WHO聯(lián)系索取、保管和使用。新建標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)替換批的制備和標(biāo)定新建標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制：原材料選擇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的配制、分裝、凍干和熔封標(biāo)定協(xié)作標(biāo)定活性值的確定穩(wěn)定性研究標(biāo)準(zhǔn)品的審定保存與效期3.1生物制品的標(biāo)準(zhǔn)化3.1.2生物制品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的審批檢定所組織檢定衛(wèi)生部生物制品標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)審查衛(wèi)生部審批發(fā)放比準(zhǔn)證書(shū)標(biāo)簽及說(shuō)明書(shū)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的索取與保管1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是指來(lái)源清楚或遺傳背景明確，符合微生物控制指標(biāo)要求，用于生物制品生產(chǎn)、檢定及科研的動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施：選址、建筑要求、區(qū)域劃分、環(huán)境條件實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)管理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的供應(yīng)和使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的檢疫和傳染病的控制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物工作人員1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常用的幾種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠金黃地鼠豚鼠家兔獼猴2生物制品的質(zhì)量檢定2.1生物制品的理化檢定2.2生物制品的安全檢定2.3生物制品的效力檢定2.1生物制品的理化檢定參照《生物制品化學(xué)檢定規(guī)程》物理性狀檢查蛋白質(zhì)含量測(cè)定防腐劑含量測(cè)定純度檢查其它外觀真空度及溶解時(shí)間半微量定氮法酚試劑法紫外吸收法苯酚含量測(cè)定汞類(lèi)防腐劑含量測(cè)定氯仿含量測(cè)定游離甲醛含量測(cè)定區(qū)帶電泳免疫電泳凝膠層析水份含量測(cè)定氫氧化鋁與磷酸鋁含量測(cè)定磷含量測(cè)定O-乙?；繙y(cè)定2.2生物制品的安全檢定一般安全性檢查殺菌、滅活和脫毒情況的檢查外源性污染檢查過(guò)敏性物質(zhì)檢查2.2生物制品的安全檢定一般安全性檢查安全實(shí)驗(yàn)無(wú)菌實(shí)驗(yàn)熱源實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基抽樣本試驗(yàn)系將一定劑量的供試品靜脈注入家兔，在規(guī)定期間內(nèi)觀察家兔體溫升高情況，以判定供試品中所含熱原質(zhì)的限度是否符合規(guī)定的一種方法。殺菌、滅活和脫毒情況的檢查活毒檢查

滅活疫苗解毒檢查類(lèi)毒素殘余毒力實(shí)驗(yàn)

活疫苗殘余毒力和毒性物質(zhì)檢查過(guò)敏性物質(zhì)的檢查2.3生物制品的效力檢定免疫力試驗(yàn)活菌數(shù)和活病毒滴度測(cè)定類(lèi)毒素和抗毒素的單位測(cè)定血清學(xué)實(shí)驗(yàn)其他有關(guān)效力的檢定和評(píng)價(jià)3生物制品的分包裝3.1分裝分裝前，檢定合格，標(biāo)簽完整，明確。防止錯(cuò)批，混批。無(wú)菌操作，實(shí)際裝量多于標(biāo)簽示量。3.2包裝破漏檢查。載名名稱(chēng)、批號(hào)、亞批號(hào)、有效期等。六重要生物制品的制備

（一）卡介疫苗生產(chǎn)工藝分離的一株牛型結(jié)核桿菌，每2～3星期傳代一次，前后共傳了231代，經(jīng)約13年時(shí)間，終于獲得一株毒力穩(wěn)定的減毒株?？ń槊缰圃齑蠖嗖捎帽砻媾囵B(yǎng)，少數(shù)采用深層培養(yǎng)。（1）表面培養(yǎng)：采用改良的蘇通培養(yǎng)基；培養(yǎng)溫度37～39℃，培養(yǎng)時(shí)向10～12天，生產(chǎn)的卡介苗活力高，用6～8天更幼齡的培養(yǎng)有利于制備凍干制品，采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的幼齡培養(yǎng)菌代替平衡期培養(yǎng)菌生產(chǎn)，可使活菌率由10％左右提高至30％～50％。菌膜收集后壓平，移入盛有不銹鋼珠瓶?jī)?nèi)，加入適量稀釋液，低溫下研磨，研磨好的原液稀釋成各種濃度的菌苗。（2）深層培養(yǎng)培養(yǎng)基：天冬酰胺0.5，檸檬酸鎂1.5g，磷酸二氫鉀5g

硫酸鉀0.5g，吐溫-800.5ml，葡萄糖鋅10g種子培養(yǎng)：將原代菌種轉(zhuǎn)接2次于上述培養(yǎng)基中37度培養(yǎng)7d深層培養(yǎng)：將種子液轉(zhuǎn)接到裝有6L培養(yǎng)基的8L雙臂瓶中，于37度培養(yǎng)7～9d，通氣攪拌培養(yǎng)；超濾除菌，加入

等量25％乳糖水溶液混勻，分裝，凍干，-70度

下保存。（二）白喉類(lèi)毒素

白喉類(lèi)毒素是一種用于預(yù)防白喉病的自動(dòng)免疫制劑，是由產(chǎn)毒力高的白喉棒狀桿菌培養(yǎng)，濾液經(jīng)福爾馬林脫毒后精制（或精制后脫毒）而成，通常是制成吸附制劑或與其他預(yù)防制劑配成混合制劑使用。3、脫毒白喉類(lèi)毒素經(jīng)脫毒即成為無(wú)毒、但仍保持高度抗原性的類(lèi)毒素。影響脫毒的主要因素有⑴溫度溫度越高脫毒越快，且脫毒越完善，但超過(guò)40℃對(duì)抗原性有很大破壞，一般多采用37～39℃。⑵pHpH越高脫毒越快，但堿性過(guò)強(qiáng)對(duì)抗原性有很大破壞，故PH在7.0±7.5較為適宜。⑶甲醛濃度甲醛濃度越高脫毒越快，但甲醛濃度過(guò)高時(shí)脫毒后殘余甲酸量過(guò)高，對(duì)抗原性有損害，并會(huì)引起注射時(shí)的強(qiáng)烈刺痛。⑷含氮量毒素含氮量越高脫毒時(shí)所需甲醛量越大，按毒素氨基氮含量加適量甲醛脫毒，既能脫毒完善，又避免過(guò)多的殘余甲醛量損壞抗原性。（三）乙型肝炎疫苗的制備乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus，HBV）屬嗜肝DNA病毒科（hepadnaviridae）。

HBV的發(fā)現(xiàn)源于表面抗原的研究。1963年Blumberg首先在澳大利亞土著人血清中發(fā)現(xiàn)一種新抗原，稱(chēng)為澳大利亞抗原（Australiaantigen）；直至1968年確定這種抗原與血清型肝炎密切相關(guān)，稱(chēng)為肝炎相關(guān)抗原（hepatitisassociatedantigen，HAA）；1970年D.S.Dane在肝炎患者血清中發(fā)現(xiàn)具有傳染性的顆粒，即Dane顆粒（Dane'sparticle）。從而HBV被確認(rèn)。

HBV是乙型肝炎病原體，主要經(jīng)輸血、注射、性行為和母嬰傳播。起病徐緩，部分患者可轉(zhuǎn)為慢性，少數(shù)還可導(dǎo)致肝硬化和肝癌。乙肝病毒發(fā)病區(qū)域全世界約有20億人感染了該病毒，約有3.5億人患有慢性感染。估計(jì)每年有60萬(wàn)人死于急性或慢性乙型肝炎。中國(guó)6.9億人曾感染過(guò)乙肝病毒，其中1.2億人長(zhǎng)期攜帶乙肝病毒，據(jù)專(zhuān)家估計(jì)，目前全國(guó)有現(xiàn)患慢性乙肝病人3,000萬(wàn)人，高發(fā)地區(qū)為西北兩省(甘肅、青海),年平均發(fā)病率為213.49/10萬(wàn)～218.41/10萬(wàn)。中發(fā)地區(qū)為西部6省市(寧夏、新疆、內(nèi)蒙古、重慶、四川、陜西),中部4省市(河南、山西、湖北、海南),以及東部2省市(廣東、福建),年平均發(fā)病率為88.19/10萬(wàn)～153.30/10萬(wàn)。低發(fā)地區(qū)主要為東部省市(北京、天津、河北、黑龍江、遼寧、吉林、上海、江蘇、安徽、山東),年平均發(fā)病率為25.41/10萬(wàn)～84.21/10萬(wàn)。廣西發(fā)病率排在全國(guó)第5位。乙型肝炎病毒形態(tài)與結(jié)構(gòu)

完整的HBV顆粒亦稱(chēng)Dane顆粒，直徑為42nm，具有雙層核殼結(jié)構(gòu)：核心顆粒：直徑為28nm。顆粒內(nèi)部：DNA和DNA多聚酶。顆粒表面（內(nèi)衣殼）：含有HBcAg

和HBeAg

。外殼（包膜）：厚7nm。脂質(zhì)雙層：含有HBsAg、PHSAr

和PreSAg蛋白質(zhì)HBV感染血清標(biāo)志及其臨床意義HBsAgHBeAg抗HBc

抗HBe抗HBs結(jié)果解釋IgMIgG-----+感染過(guò)HBV或接種過(guò)乙肝疫苗,有免疫力+----/+-肝功正常為無(wú)癥狀攜帶者;肝功異常為正患乙肝;+--++-（小三陽(yáng)）正患乙肝,肝炎趨向好轉(zhuǎn)，有傳染性++/--++-正患肝炎,或趨于恢復(fù)，有傳染性+++/----（大三陽(yáng)）正患乙肝,病毒復(fù)制,傳染性強(qiáng)---+/-++乙型肝炎恢復(fù)期乙肝疫苗的制備－血源疫苗

特點(diǎn):(1)血源取得困難;(2)疫苗需經(jīng)安全試驗(yàn),故費(fèi)用大,生產(chǎn)周期達(dá)65周.

(3)現(xiàn)已淘汰。乙肝疫苗的制備－人工合成多肽疫苗工藝過(guò)程:人工合成HBsAg的P25多肽,并在124與137位半胱氨酸殘基之間引入-S-S-,使成環(huán)狀多肽,用其免疫動(dòng)物后,50%出現(xiàn)抗體應(yīng)答。特點(diǎn):純凈,不會(huì)污染其他病毒,無(wú)傳染性,原材料來(lái)源方便,但目前生產(chǎn)成本高,難以大量生產(chǎn)。乙肝疫苗的制備－基因工程疫苗工藝路線:(1)

將HBV的DNA片段插入到質(zhì)粒并引入到E.coli中,使其復(fù)制表達(dá)抗原物質(zhì)。(2)

將HBV的DNA片段插入到牛痘病毒,再由此病毒重組體感染細(xì)胞,可分泌HBsAg。(3)用一含HbsAg的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO),在該細(xì)胞中表達(dá)HbsAg蛋白,釋放于培養(yǎng)液中,從培養(yǎng)液中提純抗原蛋白。

曾研究過(guò)用真核和原核細(xì)胞作為表達(dá)宿主，包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、酵母、細(xì)菌和病毒等。目前大規(guī)模生產(chǎn)的表達(dá)系統(tǒng)有釀酒酵母、畢赤酵母和漢遜酵母等基因工程疫苗，其次為CHO細(xì)胞基因工程疫苗，還有HBsAg+PreS2或HBsAg+PreS1+PreS2（CHO細(xì)胞和酵母表達(dá)系統(tǒng)）。七核酸疫苗1概念它是利用基因重組技術(shù)直接將編碼某種抗原蛋白的外源基因（DNA）與質(zhì)粒重組后，直接導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，并通過(guò)宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對(duì)該抗原蛋白的免疫應(yīng)答，以達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。2發(fā)展歷史1990年Wolff等偶然發(fā)現(xiàn)給小鼠肌肉注射外源性重組質(zhì)粒后，質(zhì)粒被攝取并能在體內(nèi)至少兩個(gè)月穩(wěn)定地表達(dá)所編碼蛋白。1991年Willams等發(fā)現(xiàn)外源基因輸入體內(nèi)的表達(dá)產(chǎn)物可誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。1992年Tang等將表達(dá)人生長(zhǎng)激素的基因質(zhì)粒DNA導(dǎo)入小鼠皮內(nèi)，小鼠產(chǎn)生特異性抗體，從而提出了基因免疫的概念。1993年Ulmer等證實(shí)小鼠肌肉注射含有編碼甲型流感病毒核蛋白（NP）的重組質(zhì)粒后，可有效地保護(hù)小鼠抗不同亞型、分離時(shí)間相隔34年的流感病毒的攻擊。隨后的大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都說(shuō)明在合適的條件下，DNA接種后既能產(chǎn)生細(xì)胞免疫又能引起體液免疫。1994年在日內(nèi)瓦召開(kāi)的專(zhuān)題會(huì)議上將這種疫苗定名為核酸疫苗。核酸疫苗的出現(xiàn)與發(fā)展是疫苗發(fā)展史上的第三次革命。3、核酸疫苗的作用機(jī)制（1）