,.沉淀蛋白質(zhì)的常用方法（TCA、乙醇、丙酮沉淀蛋白操作步驟）TCA-DOCForprecipitationofverylowproteinconcentration精品文檔放心下載Toonevolumeofproteinsolution,add1/100vol.of2%DOC(Nadeoxycholate,detergent).謝謝閱讀Vortexandletsitfor30minat4oC.精品文檔放心下載Add1/10ofTrichloroaceticacid(TCA)100%vortexandletsitONat4oC(preparationof100%TCA:454mlH2O/kgTCA.Maintainindarkbottleat4oC.Becareful,usegloves).精品文檔放心下載Spin15min4oCinmicrofugeatmaximumspeed(15000g).Carefully精品文檔放心下載dischargesupernatantandretainthepellet:drytubebyinversionon精品文檔放心下載tissuepaper(pelletmaybedifficulttosee).[OPTION:Washpellettwice感謝閱讀withonevolumeofcoldacetone(acetonekeepat–20oC).Vortexand謝謝閱讀repelletsamples5minatfullspeedbetweenwashes].感謝閱讀Drysamplesundervaccum(speedvac)ordryair.ForSDS,resuspendsamplesinaminimalvolumeofsamplebuffer.(ThepresenceofsomeTCAcangiveayellowcolourasaconsequenceofthe謝謝閱讀,.acidificationofthesamplebuffer;titratewith1NNaOHor1MTrisHCl謝謝閱讀pH8.5toobtainthenormalbluesamplebuffercolour.)感謝閱讀NormalTCAToeliminateTCAsolubleinterferencesandproteinconcentration精品文檔放心下載ToasampleofproteinsolutionaddTrichloroaceticacid(TCA)100%toget13%finalconcentration.Mixandkeep5min–20oCandthen15min4oC;orlongertimeat4oCwithoutthe–20oCstepforlowerproteinconcentration.Suggestion:leaveONiftheproteinconcentrationisverylow.感謝閱讀(preparationof100%TCA:454mlH2O/kgTCA.Maintainindarkbottleat4oC.Becareful,usegloves).精品文檔放心下載Spin15min4oCinmicrofugeatmaximumspeed(15000g).Carefullydischargesupernatantandretainthepellet:drytubebyinversionontissuepaper(pelletmaybedifficulttosee).精品文檔放心下載ForSDS,resuspendsamplesinaminimalvolumeofsamplebuffer.(ThepresenceofsomeTCAcangiveayellowcolourasaconsequenceoftheacidificationofthesamplebuffer;titratewith1N精品文檔放心下載,.NaOHor1MTrisHClpH8.5toobtainthenormalbluesamplebuffer謝謝閱讀colour.)AcetonePrecipitationToeliminateacetonesolubleinterferencesandproteinconcentration精品文檔放心下載Addto1volumeofproteinsolution4volumesofcoldacetone.Mixandkeepatleast20min–20oC.(Suggestion:leaveONiftheproteinconcentrationisverylow).精品文檔放心下載Spin15min4oCinmicrofugeatmaximumspeed(15000g).Carefullydischargesupernatantandretainthepellet:drytubebyinversionontissuepaper(pelletmaybedifficulttosee).感謝閱讀Drysamplesundervaccum(speed-vac)ordryairtoeliminateanyacetoneresidue(smelltubes).ForSDS,resuspendsamplesinaminimalvolumeofsamplebuffer.謝謝閱讀EthanolPrecipitationUsefulmethodtoconcentrateproteinsandremovalofGuanidine謝謝閱讀HydrochloridebeforeSDS精品文檔放心下載,.Addto1volumeofproteinsolution9volumesofcoldEthanol100%.Mixandkeepatleast10min.at–20oC.(Suggestion:leaveON).精品文檔放心下載Spin15min4oCinmicrocentrifugeatmaximumspeed(15000g).Carefullydischargesupernatantandretainthepellet:drytubebyinversionontissuepaper(pelletmaybedifficulttosee).謝謝閱讀Washpelletwith90%coldethanol(keepat–20oC).Vortexandrepelletsamples5minatfullspeed.謝謝閱讀Drysamplesundervaccum(speedvac)ordryairtoeliminateanyethanolresidue(smelltubes).ForSDS,resuspendsamplesinaminimalvolumeofsamplebuffer.精品文檔放心下載TCA-DOC/AcetoneUsefulmethodtoconcentrateproteinsandremoveacetoneandTCA精品文檔放心下載solubleinterferencesToonevolumeofproteinsolutionadd2%Nadeoxycholate(DOC)to0.02%final(for100μlsample,add1μl2%DOC).精品文檔放心下載Mixandkeepatroomtemperatureforatleast15min.謝謝閱讀100%trichloroaceticacid(TCA)toget10%finalconcentration感謝閱讀,.(preparationof100%TCA:454mlH2O/kgTCA.Maintainindark感謝閱讀bottleat4oC.Becareful,usegloves).感謝閱讀Mixandkeepatroomtemperatureforatleast1hour.謝謝閱讀Spinat4oCfor10min,removesupernatantandretainthepellet.Drytubebyinversionontissuepaper.謝謝閱讀Add200μloficecoldacetonetoTCApellet.感謝閱讀Mixandkeeponiceforatleast15min.感謝閱讀Spinat4oCfor10mininmicrocentrifugeatmaximumspeed.謝謝閱讀Removesupernatantasbefore(5),dryairpellettoeliminateany精品文檔放心下載acetoneresidue(smelltubes).ForSDS,resuspendsamplesinaminimalvolumeofsamplebuffer.精品文檔放心下載(ThepresenceofsomeTCAcangiveayellowcolourasaconsequenceoftheacidificationofthesamplebuffer;titratewith1NNaOHor1MTrisHClpH8.5toobtainthenormalbluesamplebuffercolour.)精品文檔放心下載,.AcidifiedAcetone/Methanol謝謝閱讀Usefulmethodtoremoveacetoneandmethanolsolubleinterferences感謝閱讀likeSDSbeforeIEFPrepareacidifiedacetone:120mlacetone+10μlHCl(1mMfinalconcentration).精品文檔放心下載Prepareprecipitationreagent:Mixequalvolumesofacidifiedacetoneandmethanolandkeepat-20oC.謝謝閱讀Toonevolumeofproteinsolutionadd4volumesofcoldprecipitationreagent.MixandkeepONat-20oC.謝謝閱讀Spin15min4oCinmicrofugeatmaximumspeed(15000g).Carefullydischargesupernatantandretainthepellet:drytubebyinversionontissuepaper(pelletmaybedifficulttosee).感謝閱讀Drysamplesundervaccum(speed-vac)ordryairtoeliminateanyacetoneormethanolresidue(smelltubes).感謝閱讀TCA-EthanolPrecipitationUsefulmethodtoconcentrateproteinsandremovalofGuanidine謝謝閱讀HydrochloridebeforeSDS謝謝閱讀,.1)Dilute10-25μlsamplesto100μlwithH2O精品文檔放心下載Add100μlof20%trichloroaceticacid(TCA)andmix(preparationof謝謝閱讀100%TCA:454mlH2O/kgTCA.Maintainindarkbottleat4oC.Becareful,感謝閱讀usegloves).Leaveinicefor20min.Spinat4oCfor15mininmicrocentrifugeatmaximumspeed.感謝閱讀Carefullydischargesupernatantandretainthepellet:drytubebyinversionontissue(pelletmaybedifficulttosee).感謝閱讀Washpelletwith100μlice-coldethanol,dryandresuspendinsamplebuffer.感謝閱讀IncasetherearetracesofGuHClpresent,samplesshouldbeloadedimmediatelyafterboilingfor7minat95°C謝謝閱讀(ThepresenceofsomeTCAcangiveayellowcolourasaconsequenceoftheacidificationofthesamplebuffer;titratewith1NNaOHor1MTrisHClpH8.5toobtainthenormalbluesamplebuffercolour.)精品文檔放心下載PAGEprepTMProteinClean-upandEnrichmentKit-PIERCE謝謝閱讀,.ThePAGEprep?Kitenablesremovalofmanychemicalsthatinterfere感謝閱讀withSDSanalysis:guanidine,ammoniumsulfate,othercommon感謝閱讀salts,acidsandbases,detergents,dyes,DNA,RNA,andlipids.精品文檔放心下載PIERCE:#26800-PAGEprepTMProteinClean-upandEnrichment精品文檔放心下載Kit(pdf)ChloroformMethanolPrecipitation感謝閱讀UsefulmethodforRemovalofsaltanddetergents精品文檔放心下載Tosampleofstartingvolume100ul感謝閱讀Add400ulmethanolVortexwellAdd100ulchloroformVortexAdd300ulH2OVortexSpin1minute@14,0000gRemovetopaqueouslayer(proteinisbetweenlayers)精品文檔放心下載Add400ulmethanol,.VortexSpin2minutes@14,000gRemoveasmuchMeOHaspossiblewithoutdisturbingpellet精品文檔放心下載Speed-VactodrynessBringupin2XsamplebufferforPAGE謝謝閱讀Reference:Wessel,D.andFlugge,U.I.Anal.Biochem.(1984)138,精品文檔放心下載141-143蛋白質(zhì)濃縮——方法很全1130徐爐李2011-05-2814:35樓主蛋白質(zhì)濃縮——方法很全-丁香園論壇-醫(yī)學(xué)/藥學(xué)/生命科學(xué)論壇精品文檔放心下載蛋白質(zhì)濃縮方法總結(jié)一個簡便的方法你可以試試：找一透析袋，底部扎緊，袋口扎一去底的塑料或玻璃試管，將精品文檔放心下載待濃縮的液體從管口灌入透析袋中，將整個裝置掛在冰箱中，或者用電風(fēng)扇吹，液體干后可謝謝閱讀再繼續(xù)加入，直至樣品濃縮至所需體積。如必要，可事先將待濃縮液用蒸餾水或去離子水透感謝閱讀析以去鹽分，然后再按上述方法濃縮，這樣可以避免濃縮后鹽份過高。此法簡便易行，我們精品文檔放心下載實驗室常用此法濃縮。濃縮后的液體可以用吸管從試管口吸出，而且透析袋只要不破裂，可謝謝閱讀以反復(fù)使用?？梢杂胢illipore公司的amiconultra－15cenfilterunitetrifugalunits。每個30多元，感謝閱讀但是效果非常好。只需要將培養(yǎng)上清加入，然后高速離心后即可直接得到無菌的濃縮液。感謝閱讀對于新的透析袋有化學(xué)雜質(zhì)，需要處理，為了去除這些雜質(zhì)，通常我們用10mmol/L的碳謝謝閱讀酸氫鈉，1mmol/L的EDTA溶液煮沸30min，之后用雙蒸水充分沖洗，之后放在EDTA溶精品文檔放心下載液4度保存！防止微生物污染?。±鋬龈稍锘騪eg20000都可以此種方法就是超濾濃縮，使用方式有的是離心，有的是加壓，有的二者皆用。除了amicon謝謝閱讀之外，我知道賽多利斯也是很有名的供應(yīng)廠家，就是做天平很出名的那家德國公司。超濾濃謝謝閱讀縮這種方式的確太方便了，而且除了有濃縮作用外，還有脫鹽功能，速度又快，比傳統(tǒng)的透謝謝閱讀析好多了，實驗室用和生產(chǎn)用型號都能找到。不過據(jù)介紹，不能反復(fù)用！而且價格大家也知感謝閱讀道了，30元左右，一般一個包裝25個，100個，單個還不知道賣不賣。根據(jù)中國國情，精品文檔放心下載呵呵，我建議沒經(jīng)費的實驗室還是不要考慮啦；如果時間不緊張，不怕花幾天時間，用25感謝閱讀,.元/米的透析袋一樣可以達(dá)到效果。冷凍干燥的體積當(dāng)然越小越好了，如果你的蛋白很穩(wěn)定那-70度應(yīng)該沒有什么問題的，我覺謝謝閱讀得冷凍干燥時間長，如果量不大直接用沉淀的方法濃縮就可以了。濃縮的目的是使體積小這感謝閱讀樣快，而體積很大的話冷凍干燥慢，如果你的冷凍干燥機的真空、泵很好，那么體積大也沒謝謝閱讀有關(guān)系，但是要保證你的液體的高度別超過2cm那其實也是很快的，所以關(guān)鍵看你樣品的精品文檔放心下載體積和你機器的好壞了。可以試一下下面這個簡單的辦法：直接向要濃縮的蛋白質(zhì)樣品中加入sephadexG25干粉，謝謝閱讀待干粉吸水后離心取上清即可，這樣離子強度保持不變，又達(dá)到了濃縮的目的感謝閱讀我是用雙蒸水進(jìn)行除鹽的，就是在剛開始的時候要多換幾次雙蒸水，一般24小時就可以了。精品文檔放心下載樓上占戰(zhàn)友們所說的millipore的超濾離心管我本來想買的，但考慮到價格的問題就放棄謝謝閱讀了。將樣品放在透析袋中，注意留出一半的容積，（以免水將透析袋漲破）24小時后將透感謝閱讀析袋放入20%的分子量為10000的聚乙二醇中，一般幾個小時就可以了。我買的是進(jìn)口分感謝閱讀裝的PEG，感覺不錯。希望能對你有所幫助。三氯乙酸沉淀可能會使蛋白變性的，那么再用PBS或別的緩沖液都難溶解，所以我覺得如謝謝閱讀果要想保持蛋白的活性還是別用這樣的方法。電泳樣品當(dāng)然可以，但是要注意你的樣品用緩感謝閱讀沖液難溶解，可以直接加電泳上樣緩沖液就可以了，沒有必要再用PBS溶解。感謝閱讀三氯乙酸沉淀后，樣品要用丙酮洗，然后要吹干，然后可以重新溶解精品文檔放心下載般可以將樣品放入透析袋，再將周圍撒多點PEG20000，半天能夠濃縮10倍以上精品文檔放心下載如果打算用PEG的話，要選擇好PEG的型號，某型號透析袋透過分子量的大小，還好考慮精品文檔放心下載你的目的蛋白分子量的大小。我用過PEG2000，回收很方便。它的熔點很低，大約只有50精品文檔放心下載度。就現(xiàn)在的天氣，把它平鋪在磁盤里，自然干燥就行了。精品文檔放心下載不建議大家選用太小分子量的Peg，要根據(jù)透析帶來選擇，我一般是選用透析膜能通過精品文檔放心下載分子量的兩倍以上的Peg，如果大家只用來做Western，用蔗糖就行了。精品文檔放心下載1)我們在做sds的時候，樣品的濃縮是用1M的三氯乙酸，離心以后再加丙酮進(jìn)行清謝謝閱讀洗，把三氯乙酸除去，如果三氯乙酸沒有除干凈的話，樣品加了LOADINGBUFFER以后感謝閱讀會變成黃色，不知道你有沒有出現(xiàn)這種現(xiàn)象？個人認(rèn)為秀芬蘭旁邊的黑糊糊的一團(tuán)東西可能精品文檔放心下載是樣品中的一些小分子的物質(zhì)。2）有的樣品處理過程一樣，但寬窄不一，原因可能是樣品中的鹽濃度不一致，鹽濃度過高感謝閱讀會顯著影響蛋白質(zhì)的電泳，使蛋白質(zhì)條帶明顯變寬，有時還會成微笑狀。感謝閱讀我的經(jīng)驗與老兄不同:1.膠中蛋白條帶寬窄不一原因是:因為蛋白結(jié)合電荷量不同!即所加樣品中蛋白含量不同!謝謝閱讀2.鹽濃度過高不會顯著影響蛋白質(zhì)的電泳.我用硫酸銨分級沉淀時蛋白未透析.sds蛋謝謝閱讀白條帶沒有變化!你可做個對照看一下!取待濃縮樣品1mL，加入100uL三氯醋酸，振蕩混勻后于4oC靜置30后離心（10000X10精品文檔放心下載min),去除上清,沉淀中加入1mLacetone(-20oC預(yù)冷)，劇烈振蕩混勻后.10000rpmX5精品文檔放心下載min,此步可以重復(fù)一次以保證三氯醋酸可以完全除去，最后將管子在室溫放置30分鐘干燥感謝閱讀后溶解于緩沖液中電泳分析。如果不是預(yù)冷的丙酮，可以在低溫冰箱中靜置10分鐘即可。謝謝閱讀看到大家在論壇上經(jīng)常討論這個問題，我也湊湊熱鬧！關(guān)于TCA沉淀蛋白作為SDS－PAGE上樣的準(zhǔn)備在本論壇的貼子很多，各種各樣的精品文檔放心下載protocols都有，不過總結(jié)來說都是含兩個方面，一是TCA沉淀，二是用丙酮洗去殘留的精品文檔放心下載TCA！也許是大家做上游做的多了，對于這個不太熟悉；也許是大家提供的方案太多，仔細(xì)感謝閱讀看都不太相同，亂了思緒，我也提提我的看法，希望能理清思緒！謝謝閱讀TCA沉淀蛋白的方法據(jù)我所知，最早是lowry于1951年發(fā)表在JBC上的一篇題為謝謝閱讀“PROTEINMEASUREMENTWITHTHEFOLINPHENOLREAGENT”上用過的，當(dāng)然這精品文檔放心下載篇文章也就是著名的lowry法定量蛋白的提出篇！隨后在很多文獻(xiàn)，包括現(xiàn)今新的處理蛋感謝閱讀白的文獻(xiàn)中也有采用，可見這個方法如何的被青睞！具體操作方面，不管你用什么4：1的體積比也好，還是摩爾濃度（1MTCA）也好，一般精品文檔放心下載TCA的終濃度在5％－10％（W/V）都可以！我從書上節(jié)選了這么樣的一段英文，大家可感謝閱讀以看看：Weroutinelyprecipitatesampleswithtrichloroaceticacid(TCA)beforeSDS.精品文檔放心下載Thisconcentratesthesamples,eliminatesagreatdealofbuffervariability,and謝謝閱讀denaturesproteinasesandsubstratesinarapidstepthatdoesnotallowtimefor精品文檔放心下載extensiveartifactualproteolysis.Typically,afinalconcentrationofTCAof5%(w/v)謝謝閱讀at4°Cfor10minwillbeadequate.Theprecipitatedproteinsarerecoveredbybrief精品文檔放心下載centrifugation(10,000gfor1min,inabenchtopmicrocentrifuge),andtheTCAis謝謝閱讀pouredaway.ResidualTCA,whichwouldotherwisechangethepHofthesample精品文檔放心下載buffer,isremovedbyrepeatedgentlewashingwithacetoneordiethylether,and精品文檔放心下載afterthreewashes,theproteinpelletisredissolvedinSDSsamplebuffer.謝謝閱讀下面的兩篇文獻(xiàn)可供參考：I.PolacheckandE.Cabib,Anal.Biochem.117,311(1981).謝謝閱讀2.ENRICOCABIBandITZHACKPOLACHECK,methodsinenzymology104卷，415精品文檔放心下載－416丙酮干燥時間一定不能太長，否則pellet很難溶的，這是我的經(jīng)驗精品文檔放心下載我看最簡單的是將低濃度蛋白裝入合適透析袋用PEG6000-8000包埋，每10min換一次謝謝閱讀PEG6000-8000,濃縮至微量體積后再用合適緩沖液透析有可能進(jìn)入的微量小分子PEG，速謝謝閱讀度很快，我用它作過病毒的濃縮丙酮沉淀都說會丟失蛋白質(zhì)，可是還有這么多人用沉淀法！精品文檔放心下載1、到底會丟失多少蛋白質(zhì)？？2、為什么會丟失3、尿素和其他裂解液的成分溶于丙酮嗎？？如果跟著沉淀下來，會不會影響上樣液中各種精品文檔放心下載成分的濃度，進(jìn)而影響聚焦？4、丙酮風(fēng)干不充分，會影響IEF聚焦嗎？？5、一般你們沉淀多久最少多久6、丙酮沉淀真的可以去除離子嗎？我的標(biāo)本同樣沉淀，為什么有時電壓上不去有時上的謝謝閱讀去？1,肯定會丟失蛋白質(zhì),具體丟多少取決于樣品的種類.2,有些蛋白質(zhì)一經(jīng)沉淀之后難以再溶解.3,應(yīng)該不會跟著沉淀下來,至少絕大部分不會.4,一般5分鐘風(fēng)干足夠了,盡量充分.5,最少2小時以上以沉淀完全,減少丟失的蛋白質(zhì)。偶常用沉淀過夜。謝謝閱讀６，可去除大部分離子，但還有一小部分會跟著沉淀。丙酮中可以加ＤＴＴ，也可以不加。建議還是加,對溶解性有好處.-20度沉淀過夜沒問題.謝謝閱讀我用丙酮沉淀發(fā)酵液的蛋白質(zhì)，發(fā)酵液含有磷酸鹽緩存液，用丙酮沉淀后鹽含量很高。我做感謝閱讀了一個對照試驗，將丙酮直接加在一定濃度磷酸鹽緩存液中，明顯看到白色的沉淀，我感覺謝謝閱讀丙酮的去鹽不好。謝謝你，我也是因為有些懷疑這個才發(fā)帖子的。你都用鹽溶液試過了，事實勝于雄辯，看來感謝閱讀去鹽最多只是一部分。根據(jù)你的提示，回頭我試試向裂解液中加丙酮，看看尿素等會不會沉淀下來。謝謝閱讀另外，丙酮不是奪取水分，蛋白才會沉淀下來嗎？？所以溶于水的成分必然會沉淀下來。這謝謝閱讀是我的理論上的推測。（供大家討論丙酮沉淀的原理）另外我還覺得，如果裂解液的成分跟著沉淀下來，會影響上樣液中各種成分的濃度，進(jìn)而影感謝閱讀響聚焦。所以我覺得沉淀應(yīng)該考慮裂解液的成分和濃度。（個人觀點，供大家討論）感謝閱讀建議主任給上面觀點的朋友加分。有鹽的樣品其實用丙酮淀肯定鹽也會沉淀下來的，這取決于鹽的濃度和蛋白的濃度，理論上謝謝閱讀蛋白的濃度越高，沉淀損失也越少，而且沉淀的時候最好在低溫進(jìn)行，