實驗名稱：高效毛細管電泳/電導(dǎo)檢測法

測定飲用水中陰離子

實驗學(xué)時：5

實驗類型：基礎(chǔ)性實驗主講教師：謝天堯副教授實驗名稱：高效毛細管電泳/電導(dǎo)檢測法

1?引言?

毛細管電泳基本理論?

毛細管電泳中的電滲流?

參數(shù)與關(guān)系式?進樣方式?檢測器及數(shù)據(jù)工作站?毛細管電泳儀結(jié)構(gòu)?應(yīng)用示例?實驗?zāi)康?實驗內(nèi)容?預(yù)習(xí)要求內(nèi)容?引言內(nèi)容2

在電解質(zhì)溶液中，位于電場中的帶電離子在電場力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象，稱之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質(zhì)的不同，遷移速率不同，可實現(xiàn)分離。引言

1937年，蒂塞利烏斯（

Tiselius，瑞典)將蛋白質(zhì)混合液放在兩段緩沖溶液之間，兩端施以電壓進行自由溶液電泳，第一次將人血清提取的蛋白質(zhì)混合液分離出白蛋白和α、β、γ球蛋白；1948年，獲諾貝爾化學(xué)獎。在電解質(zhì)溶液中，位于電場中的帶電離子在電場力的作用下3

利用電泳現(xiàn)象對某些化學(xué)或生物物質(zhì)進行分離分析的方法和技術(shù)叫電泳法或電泳技術(shù)。按形狀分類：U型管電泳、柱狀電泳、板電泳；按載體分類：濾紙電泳、瓊脂電泳、聚丙烯酰胺電泳、自由電泳；

傳統(tǒng)電泳分析：操作煩瑣，分離效率低，定量困難，無法與其他分析相比。

1981年，Jorgenson和Luckas，用75m內(nèi)徑石英毛細管進行電泳分析，柱效高達40萬/m，促進電泳技術(shù)發(fā)生了根本變革，迅速發(fā)展成為可與GC、HPLC相媲美的嶄新的分離分析技術(shù)——高效毛細管電泳（highperformancecapillaryelectrophoresis，HPCE）。利用電泳現(xiàn)象對某些化學(xué)或生物物質(zhì)進行分離分析的方法和4高效毛細管電泳在技術(shù)上采取了兩項重要改進：一是采用了50微米（mm)內(nèi)徑的毛細管,；二是采用了高達萬伏的分離電壓。

毛細管的采用使產(chǎn)生的熱量能夠較快散發(fā)，大大減小了溫度效應(yīng)，使電場電壓可以很高。電壓升高，電場推動力大，又可進一步使柱徑變小，柱長增加，高效毛細管電泳的柱效遠高于高效液相色譜，理論塔板數(shù)高達幾十萬塊/米，特殊柱子可以達到數(shù)百萬。高效毛細管電泳在技術(shù)上采取了兩項重要改進：5高效毛細管電泳分析的特點1.儀器簡單、易自動化

電源、毛細管、檢測器、溶液瓶2.分析速度快、分離效率高

在3.1min內(nèi)分離36種無機及有機陰離子，4.1min內(nèi)分離了24種陽離子；分離柱效：105～107/m理論塔板數(shù)；3.操作方便、消耗少

進樣量極少，水介質(zhì)中進行；4.應(yīng)用范圍極廣

有機物、無機物、生物、中性分子；生物大分子等；分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、化學(xué)、環(huán)境保護、材料等；

高效毛細管電泳分析的特點6

高效毛細管電泳(HPCE)基本理論

basicprinciplesofHPCE

電泳是指帶電離子在電場中的定向移動，不同離子具有不同的遷移速度，遷移速度與哪些因素有關(guān)？

當(dāng)帶電離子以速度ν在電場中移動時，受到大小相等、方向相反的電場推動力和平動摩擦阻力的作用。高效毛細管電泳(HPCE)基本理論

basicpri7電場力：FE=qE

阻力：F=fν故：qE=fνq—離子所帶的有效電荷；E—電場強度；ν—離子在電場中的遷移速度；f—平動摩擦系數(shù)(對于球形離子：

f=6πηγ；γ

—離子的表觀液態(tài)動力學(xué)半徑；η—介質(zhì)的粘度；)所以，遷移速度：電場力：FE=qE所以，遷移速度：8或

物質(zhì)離子在電場中差速遷移是電泳分離的基礎(chǔ)。淌度μ

：單位電場強度下的平均電泳速度。

或物質(zhì)離子在電場中差速遷移是電泳分9毛細管電泳中的電滲流

electroosmoticflow，EOF1.HPCE中的電滲流現(xiàn)象

當(dāng)固體與液體接觸時，固體表面由于某種原因帶一種電荷，則因靜電引力使其周圍液體帶有相反電荷，在液-固界面形成雙電層。

當(dāng)充滿液體的毛細管兩端施加電壓時，就會發(fā)生管中液體相對于毛細管管壁表面作整體移動的現(xiàn)象，稱之為電滲流（electroosmoticflow，簡稱EOF）。

毛細管電泳中的電滲流

electroosmoticfl102.

電滲流形成的原因石英毛細管柱，內(nèi)充液pH>3時，表面電離成-SiO-,管內(nèi)壁帶負電荷，與溶液離子間形成雙電層。在高壓電場的作用下，帶正電荷的溶液表面及擴散層向陰極移動，由于這些陽離子實際上是溶劑化的，故將引起柱中的溶液整體向負極移動，速度ν電滲流。2.電滲流形成的原因11

3.電滲流的大小與方向

電滲流的大小用電滲流速度ν電滲流表示，取決于電滲淌度μ和電場強度E。即

ν電滲流=μE電滲淌度取決于電泳介質(zhì)及雙電層的Zeta電勢，即

μ=ε0εξε0—真空介電常數(shù)；ε—介電常數(shù)；ξ—毛細管壁的Zeta電勢。

ν電滲流=ε0εξ

E實際電泳分析，可在實驗測定相應(yīng)參數(shù)后，按下式計算

ν電滲流=Lef/teoLef—毛細管有效長度；teo—電滲流標記物（中性物質(zhì)）的遷移時間。3.電滲流的大小與方向12孔隙率與孔徑：

電滲流的方向取決于毛細管內(nèi)表面電荷的性質(zhì)：內(nèi)表面帶負電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向陰極；內(nèi)表面帶正電荷，溶液帶負電荷，電滲流流向陽極；石英毛細管；帶負電荷，電滲流流向陰極；改變電滲流方向的方法：

（1）毛細管改性表面鍵合陽離子基團；

（2）加電滲流反轉(zhuǎn)劑內(nèi)充液中加入大量的陽離子表面活性劑，將使石英毛細管壁帶正電荷，溶液表面帶負電荷。電滲流流向陽極?？紫堵逝c孔徑：電滲流的方向取決于毛細管內(nèi)表面電荷的性質(zhì)13

4.電滲流的流型

電荷均勻分布，整體移動，電滲流的流動為平流，塞式流動（譜帶展寬很?。?/p>

液相色譜中的溶液流動為層流，拋物線流型，管壁處流速為零，管中心處的速度為平均速度的2倍（引起譜帶展寬較大）。4.電滲流的流型14

5.HPCE中電滲流的作用電滲流的速度約等于一般離子電泳速度的5～7倍；

各種帶電離子在毛細管柱中的遷移速度為：

ν+=ν電滲流+ν+ef陽離子運動方向與電滲流一致；ν-=ν電滲流-ν-ef陰離子運動方向與電滲流相反；ν0=ν電滲流中性粒子運動方向與電滲流一致；（1）可一次完成陽離子、陰離子、中性粒子的分離；（2）改變電滲流的大小和方向可改變分離效率和選擇性，如同改變LC中的流速；（3）電滲流的微小變化影響結(jié)果的重現(xiàn)性；在HPCE中，控制電滲流非常重要。5.HPCE中電滲流的作用156.影響電滲流的因素（1）電場強度的影響

電滲流速度和電場強度成正比，當(dāng)毛細管長度一定時，電滲流速度正比于工作電壓。（2）毛細管材料的影響

不同材料毛細管的表面電荷特性不同，產(chǎn)生的電滲流大小不同；6.影響電滲流的因素（2）毛細管材料的影響16（3）電泳運行液的影響溶液pH的影響

對于石英毛細管，溶液pH增高時，表面電離多，電荷密度增加，管壁zeta電勢增大，電滲流增大；pH<3，完全被氫離子中和，表面幾乎呈中性，電滲流接近零。分析時，采用緩沖溶液來保持pH穩(wěn)定。陰離子的影響

在其他條件相同，濃度相同而陰離子不同時，毛細管中的電流有較大差別，產(chǎn)生的焦耳熱不同。緩沖溶液離子強度，影響雙電層的厚度、溶液黏度和工作電流，明顯影響電滲流大小。緩沖溶液離子強度增加，電滲流下降。（3）電泳運行液的影響17實驗52高效毛細管電泳電導(dǎo)檢測法分離檢測水中陰離子ppt課件18（4）溫度的影響

毛細管內(nèi)溫度的升高，使溶液的黏度下降，電滲流增大。溫度變化來自于“焦耳熱”；

焦耳熱：毛細管溶液中有電流通過時，產(chǎn)生的熱量；

HPCE中的焦耳熱與背景電解質(zhì)的摩爾電導(dǎo)、濃度及電場強度成正比。溫度每變化1℃，將引起背景電解質(zhì)溶液黏度變化2%～3%；（4）溫度的影響191、加入濃度較大的中性鹽，溶液離子強度增大，使溶液的黏度增大，電滲流減小。

2、加入表面活性劑，可改變電滲流的大小和方向；加入不同陽離子表面活性劑來控制電滲流。加入陰離子表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉（SDS），可以使壁表面負電荷增加，zeta電勢增大，電滲流增大；3、加入有機溶劑如甲醇、乙腈，使電滲流增大。（5）添加劑的影響1、加入濃度較大的中性鹽，溶液離子強度增大，使溶液的黏度20

HPCE中的主要參數(shù)與關(guān)系式淌度：帶電離子在單位電場下的遷移速度；淌度不同是電泳分離的基礎(chǔ)。1.絕對淌度(absolutemobility)μab

無限稀釋溶液中帶電離子在單位電場強度下的平均遷移速度，簡稱淌度?？稍谑謨灾胁殚啞?.有效淌度(effectivemobility)μef

實際溶液中的淌度(實驗中測定的)。

μef=∑aiμi

ai—溶質(zhì)i的解離度；μi—溶質(zhì)i在解離狀態(tài)下的絕對淌度3.表觀淌度

μap

離子在實際分離過程中的遷移速度（表觀遷移速度）：

νap=μapEHPCE中的主要參數(shù)與關(guān)系式淌度：帶電離子在單位電場下的遷211.遷移時間（保留時間）

HPCE兼具有電化學(xué)的特性和色譜分析的特性。有關(guān)色譜理論也適用。V—外加電壓；L—毛細管總長度；2.分離效率（塔板數(shù)）

在HPCE中，僅存在縱向擴散，σ2=2Dt

擴散系數(shù)小的溶質(zhì)比擴散系數(shù)大的分離效率高，分離生物大分子的依據(jù)。1.遷移時間（保留時間）V—外加電壓；L—毛細管總長度223.分離度

D－擴散系數(shù)；Lef－毛細管有效長；L－毛細管全長度；V－工作電壓；Δμ－二者之差。

影響分離度的主要因素；工作電壓V；毛細管有效長度與總長度比；有效淌度差。分離度可按譜圖直接由下式計算：3.分離度D－擴散系數(shù)；Lef－毛細管有效長；L－毛細管全23圖13-23吸附等溫線的類型圖13-23吸附等溫線的類型4.焦耳熱

電泳過程產(chǎn)生的焦耳熱可由下式計算：m—電解質(zhì)溶液的摩爾電導(dǎo)；I—工作電流：cm—電解質(zhì)濃度；

散熱過程中，在毛細管內(nèi)形成溫度梯度（中心溫度高），破壞了塞流，導(dǎo)致區(qū)帶展寬。改善方法：

（1）減小毛細管內(nèi)徑；（2）控制散熱；圖13-23吸附等溫線的類型圖13-23吸附等溫線的類型24

HPCE中的進樣方式

進樣量：毛細管長度的1%-2%；納升級、非常??；1.流體力學(xué)進樣方式

（1）進樣端加壓力（一般為氣壓）（2）出口端抽真空（3）虹吸進樣HPCE中的進樣方式進樣量：毛細管長度的1%-2%252.電動進樣方式

毛細管兩端加一個合適的電壓，樣品中離子的組分通過電遷移進入毛細管中。特點：

進樣不均：電歧視現(xiàn)象，淌度大的離子比淌度大的進樣量大；離子丟失：淌度大且與電滲流方向相反的離子可能進不去；特別適合黏度大的試樣?？梢酝ㄟ^電堆積效應(yīng)提高靈敏度。2.電動進樣方式特點：263.擴散進樣方式

樣品中的組分通過擴散作用進入毛細管中。4.電滲流進樣方式

樣品中的組分（特別是中性組分）通過電滲流的作用進入毛細管中，是電動進樣的延伸。5.注射器進樣方式

采用特殊裝置，通過注射器使樣品組分進入毛細管中。3.擴散進樣方式4.電滲流進樣方式5.注射器進樣方式27

HPCE的分離模式1.自由區(qū)帶模式（CZE)帶電粒子的遷移速度=電泳和電滲流速度的矢量和。正離子：兩種效應(yīng)的運動方向一致，在負極最先流出；中性粒子：無電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽離子后流出；陰離子：兩種效應(yīng)的運動方向相反；ν電滲流>ν電泳時,陰離子在負極最后流出,在這種情況下,不但可以按類分離,同種類離子由于差速遷移被相互分離。

最基本、應(yīng)用廣的分離模式；HPCE的分離模式1.自由區(qū)帶模式（CZE)陰離子：兩282.毛細管凝膠電泳（CGE)

將聚丙烯酰胺等在毛細管柱內(nèi)交聯(lián)生成凝膠。其具有多孔性，類似分子篩的作用，試樣分子按大小分離。能夠有效減小組分擴散，所得峰型尖銳，分離效率高。蛋白質(zhì)、DNA等的電荷/質(zhì)量比與分子大小無關(guān)，CZE模式很難分離，采用CGE能獲得良好分離，DAN排序的重要手段。特點：抗對流性好，散熱性好，分離度極高。無膠篩分技術(shù)：采用低粘度的線性聚合物溶液代替高粘度交聯(lián)聚丙烯酰胺。柱便宜、易制備。2.毛細管凝膠電泳（CGE)293.膠束電動毛細管色譜（MECC，MEKC）緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，其濃度達到臨界濃度，形成一疏水內(nèi)核、外部帶負電的膠束。在電場力的作用下，膠束在柱中移動。

中性分子在膠束相和溶液（水相）間分配，疏水性強的組分與膠束結(jié)合的較牢，流出時間長；可用來分離中性物質(zhì)，擴展了高效毛細管電泳的應(yīng)用范圍；3.膠束電動毛細管色譜（MECC，MEKC）30

1.根據(jù)等電點差別分離生物大分子的高分辨率電泳技術(shù)；2.毛細管內(nèi)充有兩性電解質(zhì)（合成的具有不同等電點范圍的脂肪族多胺基多羧酸混合物），當(dāng)施加直流電壓（6～8V）時，管內(nèi)將建立一個由陽極到陰極逐步升高的pH梯度；3.氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽等的所帶電荷與溶液pH有關(guān)，在酸性溶液中帶正電荷，反之帶負電荷。在其等電點時，呈電中性，淌度為零；

4.聚焦：具有不同等電點的生物試樣在電場力的作用下遷移，分別到達滿足其等電點pH的位置時，呈電中性，停止移動，形成窄溶質(zhì)帶而相互分離；5.陽極端裝稀磷酸溶液，陰極端裝稀NaOH溶液；6.加壓將毛細管內(nèi)分離后的溶液推出經(jīng)過檢測器檢測；7.電滲流在CIEF中不利，應(yīng)消除或減小。4.毛細管等電聚焦（CIEF）

1.根據(jù)等電點差別分離生物大分子的高分辨率電泳技術(shù)；315.毛細管等速電泳（CITP）

1.將兩種淌度差別很大的緩沖液分別作為前導(dǎo)離子(充滿毛細管)和尾隨離子，試樣離子的淌度全部位于兩者之間，并以同一速度移動。2.負離子分析時，前導(dǎo)電解質(zhì)的淌度大于試樣中所有負離子的。所有試樣都按前導(dǎo)離子的速度等速向陽極前進，逐漸形成各自獨立的區(qū)帶而分離。陰極進樣，陽極檢測。5.毛細管等速電泳（CITP）1.將兩種淌度差別很大32

3.不同離子的淌度不同，所形成區(qū)帶的電場強度不同(ν=μE)，淌度大的離子區(qū)帶電場強度??；沿出口到進口，將不同區(qū)帶依次排序1、2、3、4電場強度依次增大。假設(shè)“2”號中離子擴散到“3”號，該區(qū)電場強度大，離子被加速，返回到“2”區(qū)；當(dāng)“2”號中離子跑到“1”號區(qū)，離子被減速使之歸隊；4.特點：界面明顯，富集、濃縮作用；3.不同離子的淌度不同，所形成區(qū)帶的電場強度不同(ν=336.毛細管電色譜（CEC）

在毛細管壁上鍵合或涂漬高效液相色譜的固定液，以電滲流為流動相，試樣組分在兩相間的分配為分離機理的電動色譜過程；6.毛細管電色譜（CEC）在毛細管壁上鍵合或涂漬高34

HPCE的檢測器檢測器檢測限(mol/L)特點UV－可見吸收10－4～10－5近似通用，常規(guī)應(yīng)用激光光熱10-7～10-8靈敏度高，受激光器波長限制熒光非相干光誘導(dǎo)激光誘導(dǎo)10-7～10-810-10～10-11靈敏度高高靈敏度，價格昂貴折射指數(shù)10-6～10-7通用性強，結(jié)構(gòu)簡單，靈敏度較低電位電導(dǎo)安培10-5～10-710-5～10-810-8～10-10通用性，靈敏度高，價格適中。靈敏度高，要求有電活性。質(zhì)譜10-7～10-9儀器復(fù)雜，可獲得結(jié)構(gòu)信息，質(zhì)量靈敏度高放射10-8～10-11靈敏度高，操作放射性物質(zhì)有特殊要求間接法間接UV間接LIF10-4～10-510-8～10-8通用性強，靈敏度比直接法低1－2個數(shù)量級HPCE的檢測器檢測器檢測限(mol/L)特35

高效毛細管電泳儀

highperformancecapillaryelectrophoresisapparatus高效毛細管電泳儀

highperformancecap36

HPCE的儀器系統(tǒng)1.儀器主要部件

高壓電源：0～30kV；毛細管分離柱紫外、激光誘導(dǎo)熒光、電導(dǎo)、安培檢測器等。毛細管數(shù)據(jù)工作站HPCE的儀器系統(tǒng)1.儀器主要部件高壓電源：0～30k371.高壓電源（1）0～30kV穩(wěn)定、連續(xù)可調(diào)的直流電源；（2）具有恒壓、恒流、恒功率輸出；（3）電場強度程序控制系統(tǒng)；（4）電壓穩(wěn)定性：0.1%；（5）電源極性易轉(zhuǎn)換；1.高壓電源（1）0～30kV穩(wěn)定、連續(xù)可調(diào)的直流電源；382.毛細管柱

（1）材料：石英：各項性能好；玻璃：光學(xué)、機械性能差；（2）規(guī)格：內(nèi)徑20～75μm，外徑350～400μm；長度<=1m

毛細管是CE分離的心臟。理想的毛細管必須是電絕緣、紫外/可見光透明且富有彈性的，目前可以使用的有玻璃、熔融石英或聚四氟乙烯塑料等。毛細管內(nèi)徑一般為10～100μm，其截面結(jié)構(gòu)圖標意圖如圖17.23所示。2.毛細管柱（1）材料：石英：各項性能好；玻璃：光學(xué)、機械39紫外檢測器的核心部件紫外檢測器的核心部件40電導(dǎo)檢測器的核心部件電導(dǎo)檢測器的核心部件41毛細管電泳數(shù)據(jù)工作站毛細管電泳數(shù)據(jù)工作站42教學(xué)型CES2003毛細管電泳儀實物圖高壓電源進樣端檢測池電導(dǎo)檢測器數(shù)據(jù)工作站教學(xué)型CES2003毛細管電泳儀實物圖高壓電源進樣端檢測池電43

HPCE應(yīng)用示例一、離子分析

analysisofion陽離子分析

遷移方向和電滲流方向一致；4.5min內(nèi)分離了24種金屬離子；陽極進樣，陰極檢測；具有很高的靈敏度；HPCE應(yīng)用示例一、離子分析

analysisofi44陰離子分析

陰離子電泳方向和電滲流方向相反、速度接近，分析時間長、效率低；質(zhì)量小、電荷密度大的離子如：SO4-2、Cl-、F-等，電泳速率大于電滲流，陽極端流出，在陰極端無法檢測；加入電滲流改性劑，十六烷基三甲基溴化胺等，使電泳方向和電滲流方向一致，可在3.1min內(nèi)分離36種陰離子；陰極進樣，陽極檢測；離子價態(tài)及存在形態(tài)分析；陰離子分析陰離子電泳方向和電滲流方向相反、速度接近，分45二、藥物分析

analysisofpharmaceutics

檢測體液或細胞中某些代謝產(chǎn)物的分析；尿液中的氨基酸含量作為臨床診斷糖尿病的輔助手段；采用毛細管區(qū)帶電泳方式，在11min內(nèi)分離17種藥物；二、藥物分析

analysisofpharmaceut46采用MEKC模式，鑒定違禁藥物；效果優(yōu)于HPLC法采用MEKC模式，鑒定違禁藥物；效果優(yōu)于HPLC法47三、手性化合物分析

analysisofchiralcompounds

合成獲得單一手性化合物相當(dāng)困難；528種手性合成藥物，61中以單一對映體形式銷售，其他為外消旋體；檢測分析也相當(dāng)困難；研究熱點；R-反應(yīng)停是安眠藥，S-式致胎兒畸形；HPCE分離分析手性化合物的方法：加入手性選擇劑；形成配合物的穩(wěn)定常數(shù)有差異，結(jié)合HPCE的高效率；常用手性選擇劑：環(huán)糊精及其衍生物；手性冠醚；手性表面活性劑（氨基酸衍生物、膽酸鈉、?；敲撗跄懰峒捌溻c鹽、低聚糖等天然手性表面活性劑）三、手性化合物分析

analysisofchiralc48四、氨基酸與蛋白質(zhì)分析

analysisofaminoacids采用MEKC模式，在25分鐘內(nèi)分離了23種丹?；被?；HPCE可取代傳統(tǒng)的氨基酸分析儀；問題：吸附和檢測；四、氨基酸與蛋白質(zhì)分析

analysisofamino49實驗52高效毛細管電泳電導(dǎo)檢測法分離檢測水中陰離子ppt課件50五、核酸分析及DNA排序

analysisofnucleicacidsandsequence

ofDNA重要分析手段；右圖：酶解的雙螺旋DNA限制性片段的分離；五、核酸分析及DNA排序

analysisofnucle51

●學(xué)習(xí)高效毛細管電泳儀（HPCE）的操作使用。

●

熟悉高效毛細管電泳法分析的基本原理和實驗方法?！?/p>

掌握飲用水中Cl-、NO3-、SO42-的毛細管電泳分離/電導(dǎo)檢測的測定原理和技術(shù)。實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康?2實驗內(nèi)容本實驗采用四乙烯五胺作為毛細管電泳的電滲流抑制劑，以10mmol/LTris（三羥甲基