兒童腸桿菌科細(xì)菌碳青霉烯耐藥的基因型研究

碳青霉烯類抗生素是治療具有特定抗生素內(nèi)胺酶和酪氨酸酶等多重抗生素的最有效抗菌藥物。但隨著碳青霉烯類抗生素在臨床上的廣泛應(yīng)用及不合理使用,在兒童中出現(xiàn)對碳青霉烯類抗生素耐藥的菌株。因此本研究對從兒童臨床標(biāo)本中分離出20株碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌(CRE)進行碳青霉烯酶耐藥基因研究,現(xiàn)將結(jié)果報道如下。1材料和方法1.1藥物敏感試驗細(xì)菌分離鑒定參照全國臨床檢驗操作規(guī)程進行,Vitek2Compact全自動細(xì)菌鑒定儀(法國生物梅里埃公司)鑒定細(xì)菌,配套藥敏卡(GN-13)對分離自兒童腸桿菌進行藥物敏感試驗(MIC法)檢測,2013年1月至2016年2月從廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院住院兒童中共篩選出非重復(fù)厄他培南MIC濃度≥2mg/L或者美羅培南、亞胺培南的MIC濃度≥4mg/L的腸桿菌科細(xì)菌20株。體外藥敏試驗質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603。1.2表型試驗1.2.1菌株劃分及生長使用無菌生理鹽水將大腸埃希菌ATCC25922菌懸液調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠞岫?并用生理鹽水進行1∶10稀釋,用棉簽將稀釋后菌液均勻涂布于MH瓊脂平皿上,干燥10min。將厄他培南紙片置于MH瓊脂平皿上,使用1μL接種環(huán)挑取3~5個過夜生長待測菌落垂直于厄他培南紙片從紙片邊緣開始劃線,長度為20~25mm,35℃孵育16~20h。如果在被測菌株與大腸埃希菌ATCC25922抑菌圈交匯處大腸埃希菌生長增強即為產(chǎn)碳青霉烯酶。1.2.2edta溶液的制備將待測菌或質(zhì)控菌配制成0.5麥?zhǔn)暇?均勻涂布MH平皿,待干后,間隔一定距離貼兩張IPM(10μg)紙片,在其中一張IPM紙片上加10μL0.5MEDTA溶液,置35℃孵育18h。加ED-TA的紙片抑菌環(huán)直徑與不加EDTA的紙片抑菌環(huán)直徑差值≥5mm即為陽性,判斷為產(chǎn)金屬酶。1.3細(xì)菌總dna提取參考相關(guān)文獻設(shè)計并合成PCR基因引物(引物序列見表1),引物由上海英俊生物公司合成。細(xì)菌總DNA提取采用煮沸法。PCR反應(yīng),配置25μL反應(yīng)總體系:反應(yīng)條件為195℃5s;295℃40s;55℃40s;72℃1min,共35個循環(huán);372℃10min。反應(yīng)結(jié)束后,電泳鑒定產(chǎn)物。反應(yīng)在梯度PCR儀(美國Biometra公司)上進行。1.4陽性克隆菌的篩選PCR產(chǎn)物連接pMD18-TVector(大連寶生物有限公司),轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,篩選陽性克隆菌,菌液PCR鑒定。由Inviotrigen公司對重組質(zhì)粒的外源基因片段進行序列測定,測序結(jié)果與NCBIBlast進行比對(/blast/),確定耐藥基因類型。2結(jié)果2.12產(chǎn)菌菌株組成20株CRE中肺炎克雷伯菌12株,占60%,4株為粘質(zhì)沙雷菌占20%,3株為大腸埃希菌占15%,1株為陰溝腸桿菌占5%。標(biāo)本類型主要是痰液占70%,其次是血液占20%,菌株主要分布于新生兒科和兒童重癥監(jiān)護病房。2.2亞胺培南的藥物中介作用抗菌藥物敏感性結(jié)果顯示,所有菌株對氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、頭孢唑啉、頭孢曲松耐藥(100%);亞胺培南的中介率(5%),耐藥(85%);厄他培南中介率(10.00%),耐藥(80.00%);阿米卡星、環(huán)丙沙星100%敏感,見表2。2.3cre耐藥基因型檢測結(jié)果CRE耐藥表型檢測結(jié)果:20株碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌改良Hodge試驗陽性14株(70%),IPM+EDTA紙片增效試驗陽性17株(85%),ESBLs陽性率15%。以PCR方法為金標(biāo)準(zhǔn),改良Hodge試驗對20株CRE的碳青霉烯酶的檢出敏感性和特異性分別是73.68%(14/19)和100%(1/1)。假陽性0株,假陰性5株,假陰性率25%,準(zhǔn)確性75%。IPM+EDTA紙片增效試驗敏感性和特異性分別是89.47%(17/19)和100%(1/1)。假陽性0株,假陰性2株,假陰性率10%,準(zhǔn)確性90%。ESBLs陽性率15%。CRE耐藥基因型檢測結(jié)果:對20株CRE菌株中的碳青霉烯酶基因、EsBLsβ-內(nèi)酰胺酶基因進行擴增,12株肺炎克雷伯菌、4株粘質(zhì)沙雷菌、2株大腸埃希菌、1株陰溝腸桿菌中均檢出IMP基因,陽性率95%。碳青霉烯酶基因擴增結(jié)果見圖1。所有菌株未檢出KPC、GES、SME、NMC、IMC、NDM-1、VIM、SIM型碳青霉烯酶基因。編碼ESBLs酶的基因中產(chǎn)TEM型ES-BLs酶的菌株19株(95%),SHV型ESBLs酶17株(85%),未檢測出CTX-M-1、CTX-M-13型ESBLs酶的菌株,見表3。2.4結(jié)果表明，對序列結(jié)果和序列分析對19株產(chǎn)IMP金屬酶的PCR陽性產(chǎn)物進行基因測序分析,測序結(jié)果經(jīng)與NCBIBlast比對,確認(rèn)為bla3碳青霉烯酶基因檢測兒童CRE以肺炎克雷伯菌為主,產(chǎn)IMP-4型碳青霉烯酶出現(xiàn)在腸桿菌科細(xì)菌的不同菌株,產(chǎn)IMP-4型碳青霉烯酶是兒童臨床分離耐CRE主要型別,未檢測出KPC、GES、SME、NMC、IMC、NDM-1、VIM、SIM型碳青霉烯酶基因。腸桿菌科細(xì)菌對碳青霉烯類抗生素耐藥機制主要是產(chǎn)碳青霉烯酶,高產(chǎn)AmpC酶、ESBLs也可導(dǎo)致其耐藥。本研究的兒童CRE大多數(shù)菌株同時也存在超廣譜β內(nèi)酰胺酶TEM、SHV基因。超廣譜β內(nèi)酰胺酶CTX-1、CTX-13基因是西南地區(qū)超廣譜β內(nèi)酰胺酶CTX-M基因常見基因型B類金屬酶包含VIM、IMP、SIM-1、KHM