葉綠體轉基因技術的研究進展摘要：葉綠體轉基因技術是近年來發(fā)展起來的且是繼核轉基因技術之后的一個非常有效的改良植物品質的新技術，它呈現出誘人的發(fā)展前景。本文綜述了葉綠體基因工程的優(yōu)點和特點、高等植物葉綠體轉化技術的現狀、葉綠體轉化的應用、葉綠體轉化技術的局限，并且展望了葉綠體轉基因技術的發(fā)展方向和應用前景。關鍵詞：葉綠體；轉基因；優(yōu)越性核轉基因技術除了對抗除草劑、抗蟲性以及抗逆性有關的研究以外，對品質性狀相關的研究將會變得越來越重要，例如，改進油料作物脂肪的組成、增加必需氨基酸和蛋白質的含量等。核轉基因技術已顯示出它的優(yōu)越性，但葉綠體轉基因技術也有其優(yōu)點。葉綠體是植物細胞中與光合作用直接相關的細胞器，也是淀粉、脂肪酸、葉綠素、胡蘿卜素、嘌吟、嘧啶及大部分氨基酸的合成場所，它在植物中發(fā)揮著重要作用。近年來，由于重組DNA和基因工程等現代分子生物學技術的應用，包括用限制性內切酶繪制物理圖譜、基因定位、分離、擴增和鑒定，以及DNA序列快速分析法，完成了多種植物葉綠體基因組的全序列測定，并研究了這些基因的結構、功能與表達。通過對葉綠體的遺傳轉化即是將外源基因整合入葉綠體基因組的特定位點使其在葉綠體中表達和翻譯的研究，顯示出葉綠體轉基因技術的優(yōu)越性，它可以改良葉綠體的功能，從而創(chuàng)造出生產上有價值的作物新品種［1-2］。本文綜述了葉綠體基因工程的優(yōu)點和特點、研究現狀、轉化的應用以及技術的局限，并且展望了葉綠體轉基因技術的發(fā)展方向和應用前景。1葉綠體基因工程的優(yōu)越性葉綠體基因工程是以葉綠體基因組為平臺對植物進行遺傳操作，通過一定方法使外源基因穿過細胞膜和葉綠體雙層膜進入葉綠體，在同源重組片段的介導下與葉綠體基因組之間發(fā)生同源重組，以定點整合方式進入葉綠體基因組，在其中轉錄、翻譯并獲得終產物的技術。這項技術具有許多傳統的細胞核轉基因技術所不具備的優(yōu)越性。⑴表達效率高研究表明，相對于核轉化，葉綠體轉化能使外源基因表達量提高100倍以上⑶。原核基因無需修飾改造由于葉綠體大多數基因的結構、轉錄與翻譯系統均與原核生物類似，來自原核生物的有重要價值的外源基因，無需改造和修飾就可在葉綠體內高效表達［4-5］。真核蛋白可正確折疊研究表明在葉綠體中表達的蛋白可形成二硫鍵，人類蛋白也可正確折疊回。生物安全性好對大多數高等植物而言，外源基因整合到葉綠體基因組后，只能進行母系遺傳，不像核基因那樣可以隨花粉擴散。便于遺傳操作葉綠體基因組小，結構簡單?？梢詫崿F定點整合外源基因可通過同源重組定點整合進葉綠體基因組，定點整合有利于控制外源基因的表達，消除了核轉化中存在的“位置效應”。多順反子共同轉錄葉綠體中多個順反子可共同轉錄，所以按操縱子形式就可以將很多基因同時導入葉綠體中，從而為轉化和表達涉及特定生化反應的多個基因工作提供便利⑺?？稍O計適合多種植物轉化的通用載體由于不同物種葉綠體基因組中某些序列呈現高度保守的性質，用這些序列作為同源重組片斷構建的載體可適用于多個物種，如用煙草載體轉化馬鈴薯冏?？煞e累有毒蛋白而不影響植物生長［9］。易保持純系、后代不分離一旦得到純合而穩(wěn)定的葉綠體轉化體，由于外源基因的母系遺傳特性，這種純系的種子后代將永遠保持為純系，不會因為有性雜交而發(fā)生分離。2高等植物葉綠體轉化技術的現狀自從1990年Svba等首次發(fā)表穩(wěn)定的煙草葉綠體轉化以來，高等植物葉綠體轉化技術蓬勃發(fā)展，在許多方面取得了引人注目的成就。從葉綠體轉化技術涉及的高等植物物種來看，已在煙草［10］、擬南芥［U］、馬鈴薯［⑵、番茄U3］、油菜U4］、棉花3］等建立了穩(wěn)定的轉化體系，從在葉綠體中表達的基因看，已有三十種左右不同功能的外源基因成功表達，在外源DNA導入葉綠體的手段上，進行了基因槍法、農桿菌轉化法、PEG介導法、激光微束穿刺法、花粉管導入法、顯微注射法等多種方法的嘗試，并用前三種方法成功的獲得穩(wěn)定的葉綠體轉化植株。從葉綠體轉化技術應用的范圍上看，己在基礎研究和生物技術領域進行了廣泛應用，并取得了許多令人矚目的成果，尤其是用葉綠體作為植物生物反應器的研究得到了高達46%可溶蛋白的表達水平，顯示了此項技術在植物生物反應器方面實際應用于生產實踐的潛力。另外，葉綠體轉化技術也在不斷的完善中。3葉綠體轉化的應用葉綠體轉化系統的建立對葉綠體的分子生物學研究和利用具有重大意義，一方面，這套技術的建立有利于解決諸如葉綠體基因表達調控機制、核質基因的相互作用、葉綠體基因的功能鑒定以及葉綠體進化等許多理論問題。另一方面，由于葉綠體轉化在外源蛋白表達方面的各種優(yōu)越性，使之成為植物生物反應器生產外源蛋白的最佳途徑，而目前葉綠體研究的熱點也集中與此。3.1基礎研究葉綠體轉化技術的出現對葉綠體分子生物學研究特別有利，因為用體外重組操作方法對葉綠體DNA進行改造，將其導入葉綠體基因組后通過觀察和分析各項生理和生化變化，就可以獲得以前很難得到的葉綠體分子生物學方面的知識，如葉綠體基因表達調控機制、核質基因的相互作用、葉綠體基因的功能鑒定以及葉綠體進化等16］。3.2生物技術領域高等植物的葉綠體轉化一出現就引起生物技術領域的重視，特別是它與核轉化體系相比有很多獨特的優(yōu)點，使其成為未來的生物技術熱點。目前這個技術主要用于植物性狀的改造及作為表達大量外源基因產物的植物生物反應器。3.2.1植物光合作用的遺傳改造：由于葉綠體是植物的光合作用器官，所以提高作物的光合效率是葉綠體轉化技術建立后人們十分關注的工作。如Knaevski等［切將向日葵的rbcL基因轉入煙草葉綠體，以取代煙草自身的rbcL基因，發(fā)現在轉基因煙草中形成了由向日葵的Rubisoc大亞基和煙草的Rubisoc小亞基構成的完整的有活性的酶。這些工作為優(yōu)化植物的Rubisco酶的結構，提高光合性能奠定了重要基礎。3.2.2植物的抗性基因工程除光合作用外，利用葉綠體轉化技術進行農作物的品種改良主要集中在對植物的抗病蟲性及抗逆性改良方面，其中包括增加植物的抗蟲、抗病、抗早、抗除草劑的能力。在己有的關于葉綠體生物技術方面，以轉移殺蟲蛋白基因的報道最多。例如:張中林等［18-19］和侯丙凱等［20］分別將Bt殺蟲蛋白基因導入煙草和油菜葉綠體基因組，轉基因植株對鱗翅目害蟲均表現出較高抗性。抗除草劑的基因工程中應用葉綠體轉化可避免這些外源基因的擴散，提高其生物安全性，所以利用葉綠體轉化技術將相關的抗性基因導入葉綠體中更為直接，如前文介紹的工作中有用花粉管通過道法將來自抗該除草劑的龍葵psbA突變基因導入大豆中，并得到母性遺傳的阿特拉津抗性植物。3.2.3葉綠體轉化技術在植物生物反應器中應用用高等植物的葉綠體表達的外源基因的產物不僅量多，而且葉綠體的原核性也使得它適于表達來自原核蛋白的基因，并且有報導表明在葉綠體表達外源基因的蛋白產物有正確折疊及二硫鍵形成［21］，這些特性無疑會使得葉綠體表達的藥物蛋白在提純處理的費用大大降低?，F在利用高等葉綠體表達體系主要生產的藥物類蛋白和疫苗，其中有關藥物類基因的工作有:具有多種醫(yī)用價值的蛋白質類藥物“GVGVP”，煙草葉綠體中表達量為細胞核表達的100倍四:生長素基因(hST)，煙草葉綠體中最高表達量達總可溶蛋白的7%［21］，比細胞核轉化高300倍。4葉綠體轉化技術的局限高等植物的葉綠體轉化技術雖然建立，但至今為止，高等植物中只在茄科、十字花科、錦葵科、傘形科中少數高等植物上獲得了穩(wěn)定的葉綠體轉化植株，而且只有在煙草中建立起穩(wěn)定的轉化體系，獲得較高的轉化效率，而其它物種的轉化體系還不夠穩(wěn)定和廣泛，轉化率也往往偏低，暫時還無法在實際生產中應用。限制高等植物葉綠體轉化的瓶頸主要有兩點，-是大多數植物（包括重要農作物）的葉綠體基因組序列還不清楚，因此無法確定外源基因合適的插入位點。二是很多植物，特別是重要的禾谷類作物不能從葉片再生，而能夠再生的組織（包括愈傷組織、幼胚等）都不含有成熟的葉綠體，只有體積較小的前質體。這些小的質體被認為比基因槍的子彈還小，無法擊中。而且前質體中NDA分子數少，也影響篩選標記基因的表達，不利于同質化篩選，因此雖然Dnaien等"24］用基因槍對煙草的培養(yǎng)細胞以及小麥幼胚愈傷組織前質體的進行轉化，但只得到瞬時表達的結果。結束語今后-段時間內，還需大力開展高等植物的葉綠體基因組測序工作，并進一步探索轉化非綠色前質體中葉綠體DNA的可能性，以使葉綠體轉化技術應用于更多的高等植