高通量測(cè)序技術(shù)在腫瘤診斷與個(gè)體化治療中的應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)在腫瘤診斷與個(gè)體化治療中的應(yīng)用1腫瘤是一種基因病基因過表達(dá)與突變同病異突變傳統(tǒng)突變檢測(cè)的局限性NGS腫瘤是一種基因病基因過表達(dá)與突變同病異突變傳統(tǒng)突變檢測(cè)的局限2測(cè)序的歷史測(cè)序的歷史3高通量測(cè)序:一次性對(duì)幾百萬到十億條DNA分子進(jìn)行并行測(cè)序，又稱為下一代測(cè)序技術(shù)，其使得可對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行深入、細(xì)致、全貌的分析，所以又被稱為深度測(cè)序。High-throughputSequencingNextGenerationSequencingDeepSequencing高通量測(cè)序簡(jiǎn)介（NGS）高通量測(cè)序:一次性對(duì)幾百萬到十億條DNA分子進(jìn)行并行測(cè)序，又4文庫(kù)擴(kuò)增低通量Sanger測(cè)序高通量測(cè)序并行測(cè)序

高通量無需建立文庫(kù)，

兩端加測(cè)序接頭PCR擴(kuò)增文庫(kù)擴(kuò)增低通量Sanger測(cè)序高通量5ExomesequencingTranscriptomesequencingGenomesequencingTargeted

sequencinga:Roche/454,Life/APG,Polonatorb:Illumina/SolexaSolid-Phaseamplificationc:AppliedBiosystemsSOLiDsystemd:HelicosBiosciences:onepassExomesequencingTranscriptome6454測(cè)序流程454測(cè)序流程7IlluminaSolexa測(cè)序流程IlluminaSolexa測(cè)序流程8ABISOLiD測(cè)序原理ABISOLiD測(cè)序原理9三種平臺(tái)的技術(shù)差異三種平臺(tái)的技術(shù)差異101.對(duì)于研究區(qū)域比較嚴(yán)格定義的時(shí)候，Agilent平臺(tái)更適合。2.Illumina平臺(tái)能夠捕獲UTR區(qū)域，其他平臺(tái)不行。3.Agilent能檢測(cè)到最多的SNP及插入缺失。1.對(duì)于研究區(qū)域比較嚴(yán)格定義的時(shí)候，Agilent平臺(tái)更適合11科研應(yīng)用（潛在臨床應(yīng)用前景）科研應(yīng)用（潛在臨床應(yīng)用前景）12高通量測(cè)序技術(shù)在腫瘤診斷與治療中的應(yīng)用--課件13外顯子組測(cè)序ExomeSequencingAllowsforRapidGeneIdentificationinaCharcot-Marie-ToothFamilyAnnualNeurology冰桶挑戰(zhàn)讓我們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)了進(jìn)行性神經(jīng)性肌萎縮綜合征。全外顯子測(cè)序分析了這一罕見家系存在的基因突變類型

（罕見病家系）外顯子組測(cè)序ExomeSequencingAllows1410HBV（+）HCCwithPVTTsandmatchedcontrolsIllumina/Solexasequencing

ABISOLiDsequencing

Identificationofcandidatesomaticmutations.

Identificationofsomaticindels

PCR-basedSangerresequencing.

10HBV（+）HCCwithPVTTsandm15高通量測(cè)序技術(shù)在腫瘤診斷與治療中的應(yīng)用--課件16高通量測(cè)序技術(shù)在腫瘤診斷與治療中的應(yīng)用--課件17基因組DNA打斷外顯子捕獲富集文庫(kù)建立測(cè)序原始數(shù)據(jù)下機(jī)數(shù)據(jù)過濾質(zhì)控ShootingGun參考序列無有Indel,SNP統(tǒng)計(jì)氨基酸突變研究GO功能分析KEGG通路分析測(cè)序深度評(píng)估測(cè)序覆蓋度評(píng)估測(cè)序隨機(jī)性評(píng)估分析內(nèi)容測(cè)序評(píng)估基因組DNA打斷外顯子捕獲富集文庫(kù)建立測(cè)序原始數(shù)據(jù)下機(jī)數(shù)據(jù)過18外顯子組測(cè)序WeiX,

WaliaV,

etal.ExomesequencingidentifiesGRIN2Aasfrequentlymutatedinmelanoma.NatGenet黑色素瘤發(fā)生率一直在上升，此研究對(duì)黑色素瘤細(xì)胞進(jìn)行外顯子組捕獲測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了和其相關(guān)的高頻突變基因。（某種類型疾病與暴露因素相關(guān)性研究）外顯子組測(cè)序WeiX,

WaliaV,

etal.E19基因組DNA打斷外顯子捕獲富集文庫(kù)建立測(cè)序原始數(shù)據(jù)下機(jī)數(shù)據(jù)過濾質(zhì)控ShootingGun參考序列無有Indel,SNP統(tǒng)計(jì)氨基酸突變研究GO功能分析KEGG通路分析測(cè)序深度評(píng)估測(cè)序覆蓋度評(píng)估測(cè)序隨機(jī)性評(píng)估分析內(nèi)容測(cè)序評(píng)估基因組DNA打斷外顯子捕獲富集文庫(kù)建立測(cè)序原始數(shù)據(jù)下機(jī)數(shù)據(jù)過20七個(gè)新發(fā)現(xiàn)的非同義高頻突變位點(diǎn)七個(gè)新發(fā)現(xiàn)的非同義高頻突變位點(diǎn)21單個(gè)基因中突變位點(diǎn)分析基因GRIN2A模式圖，箭頭表示突變位點(diǎn)單個(gè)基因中突變位點(diǎn)分析基因GRIN2A模式圖，箭頭表示突變位22高通量測(cè)序技術(shù)在腫瘤診斷與治療中的應(yīng)用--課件23Whatcan/wouldwedo?Whatcan/wouldwedo?24基于全外顯子測(cè)序的家族遺傳性腫瘤疾病易感性研究（以下以胃癌為例）胃癌（GastricCancer）全球：第四大常見癌癥；第二大癌癥死亡率平均5年存活率22%，晚期5年存活率低于5%，男女發(fā)病率2:1中國(guó)：惡性腫瘤中居首位，西北與東南沿海地區(qū)發(fā)病率更高風(fēng)險(xiǎn)：家族遺傳、HP、飲食結(jié)構(gòu)、癌前胃部疾病、吸煙等家族遺傳因素：胃癌病人親屬的胃癌發(fā)病率較普通人高4倍以上

10%胃癌在家族中遺傳

1%-3%為CDH1基因突變帶來的家族彌漫性胃癌，其他原因目前未知罕見類型或特殊病理類型！基于全外顯子測(cè)序的家族遺傳性腫瘤疾病易感性研究（以下以胃癌為25家族性胃癌是指：高發(fā)病率區(qū)(如中國(guó))一級(jí)和(或)二級(jí)親屬中≥3例患病其中1例是另2例的一級(jí)親屬連續(xù)兩代發(fā)病至少有1例發(fā)病年齡＜50歲。家族性胃癌是指：26突破點(diǎn)在于：1、發(fā)現(xiàn)罕見疾病家系2、收集完整家族血液樣本3、剔除抑制突變、SNP及同義突變4、發(fā)現(xiàn)新的突變>SNP>copynumber突破點(diǎn)在于：27肥胖與HP（+）胃癌的關(guān)系研究胃癌（GastricCancer）全球：第四大常見癌癥；第二大癌癥死亡率平均5年存活率22%，晚期5年存活率低于5%，男女發(fā)病率2:1中國(guó)：惡性腫瘤中居首位，西北與東南沿海地區(qū)發(fā)病率更高風(fēng)險(xiǎn)：家族遺傳、HP、飲食結(jié)構(gòu)、癌前胃部疾病、吸煙等家族遺傳因素：肥胖和腫瘤是全球兩大重要的公共衛(wèi)生問題。肥胖可以增加胃癌罹患率,并且治療效果差、腫瘤病死率高,但具體機(jī)制尚不清楚。

肥胖與胃癌均存在一定家族遺傳性肥胖與HP（+）胃癌的關(guān)系研究胃癌（GastricCan28全外顯子捕獲測(cè)序獲得初篩數(shù)據(jù)Step1Step2Step3先證者母親父親DNA/RNAExtractionNext-generationSequencing數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)SNV、indelanalysis、mutantgenesRT-PCR、IHCoftargetgenesintissuesofproband功能研究BloodSamplesInvitro/vivostudy5TrioswithHP（+）TissuesTRIO家庭三口之家全外顯子捕獲測(cè)序獲得初篩數(shù)據(jù)Step1Step2Step29肥胖的定義1.BMI:<25kg/㎡normal25~30kg/㎡overweight

>30kg/㎡obesity2.WHRorWHtR（waist-to-hipratioorwaist-toheightratio

Male：>0.95obesityFemale：>0.8obesity三人同時(shí)滿足！肥胖的定義1.BMI:<25kg/㎡30HP（+）的定義胃鏡取活檢標(biāo)本檢查，分離培養(yǎng)+直接涂片檢查+病理切片未經(jīng)任何治療胃癌的定義胃鏡取活檢標(biāo)本檢查，病理檢測(cè)未經(jīng)任何治療腺癌(包括乳頭狀腺癌、管狀腺癌、粘液腺癌、印戒細(xì)胞癌)

先證者一人滿足！C14呼氣試驗(yàn)?zāi)芊翊_診HP（+）？HP（+）的定義胃鏡取活檢標(biāo)本檢查，分離培養(yǎng)+直接涂片檢查+31實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組3-5TRIOs肥胖家庭非肥胖家庭HP（+）外顯子測(cè)序普通測(cè)序驗(yàn)證DeNovo突變體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)3-5TRIOsHP（+）外顯子測(cè)序普通測(cè)序驗(yàn)證DeNovo突變體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)其他標(biāo)準(zhǔn)：性別比TNM分期先證者年齡實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組3-5TRIOs肥胖家庭非肥胖家庭HP（+）外32質(zhì)控標(biāo)本采集：TRIO全血采集（與測(cè)序公司討論所需血樣體積），采用抗凝管DNA提取（QIAmpDNABloodMinikit）及保存（1）樣品純度：OD260/280值應(yīng)在1.8～2.0之間；RNAfree。

（2）樣品濃度：最低濃度不低于50ng/μl。

（3）樣品總量：每個(gè)樣品總量不少于15μg。

（4）樣品溶劑：溶解在H20或TE（pH8.0）中。

（5）保存：DNA低溫運(yùn)輸（-20℃，干冰）質(zhì)控標(biāo)本采集：TRIO全血采集（與測(cè)序公司討論所需血樣體積）33臨床應(yīng)用臨床應(yīng)用34高通量測(cè)序技術(shù)在腫瘤診斷與治療中的應(yīng)用--課件35高通量測(cè)序技術(shù)在腫瘤診斷與治療中的應(yīng)用--課件36基于測(cè)序的腫瘤個(gè)人疾病ID建立與個(gè)體化治療方案癌癥突變用藥數(shù)據(jù)庫(kù)其他優(yōu)勢(shì)數(shù)萬份案例臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)庫(kù)NCCN及FDA數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合人群用藥情況（中國(guó)）專人監(jiān)測(cè)，實(shí)時(shí)更新血液樣本監(jiān)測(cè)遺傳信息監(jiān)測(cè)二/三期臨床藥物推薦私人訂制！基于測(cè)序的腫瘤個(gè)人疾病ID建立與個(gè)體化治療方案癌癥突變用藥數(shù)37石蠟包埋組織切片或組織塊新鮮冰凍組織血液和骨髓其他檢測(cè)流程石蠟包埋組織切片或組織塊檢測(cè)流程38CDKVEGF損傷修復(fù)基因MDM2反饋調(diào)節(jié)p21切斷腫瘤血供GD-AIFBAI-1TSP血管生成因