目的基因的篩選與獲取等的基因就是目的基因，根；等相關(guān)的基因；基因工程的基本操作程序*：①

目的基因的篩選與獲取

②基因表達(dá)載體的構(gòu)建（_核心）③將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞_④

目的基因的檢測與鑒定

目的基因的概念：在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)_胞性狀

或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物據(jù)不同的需要，目的基因是不同的，主要是指編碼蛋白質(zhì)_的基因3.常見目的基因類型：與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)

、生產(chǎn)藥_物、毒物降解和工業(yè)用酶目的基因的篩選方法：從相關(guān)的已知結(jié)_構(gòu)

和功能清晰

的基因中進(jìn)行篩選；隨著測序技術(shù)

的發(fā)展，以及序列數(shù)據(jù)庫_ （GenBank）、序列比對(duì)工具

（如BLAST）等的應(yīng)用，越來越多的基因的結(jié)構(gòu)和功能為人們所知為找到合適的目的基因提供了更多的機(jī)會(huì)和可能；Bt抗蟲蛋白的抗蟲原理是什么？當(dāng)Bt抗蟲蛋白被分解為多肽后，多肽與_與害蟲腸上皮細(xì)胞的特異性受體結(jié)

合，導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔，_，最后造成害蟲死亡

7.為什么Bt抗蟲蛋白不會(huì)對(duì)人畜產(chǎn)生危害？Bt_t_抗蟲蛋白只有在某類昆蟲_腸道的堿性環(huán)境中才能表現(xiàn)出毒性，_而人和牲畜的胃液_呈酸性，腸道細(xì)胞也沒有特異性受體_，因此，Bt抗蟲蛋白不會(huì)對(duì)人畜產(chǎn)_生上述影響的獎(jiǎng)；鏈需要13.PCR的擴(kuò)增緩沖液中一般含有

作用為

8.獲取目的基因的方法：PCR擴(kuò)增

、構(gòu)建基_因文庫、化學(xué)方法人工合成9.PCR的概念：PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保_留復(fù)制原理，在體外

提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因

核苷酸序的列

大量復(fù)進(jìn)制行

的技術(shù)①全稱：聚合酶_鏈?zhǔn)椒磻?yīng)②原理：DNA半保留復(fù)制_③操作環(huán)境：體外（P_

CR擴(kuò)增儀/PCR儀）④目的：對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制_⑤優(yōu)點(diǎn)：可以在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因_10.PCR由穆里斯等人于1985年發(fā)明，并于1993年獲得諾貝爾化學(xué)解旋酶

90℃以上高溫DNA體內(nèi)復(fù)制解旋條件為

DN，A聚P合CR酶解旋條件為

DN耐A高體溫內(nèi)的復(fù)DN制A聚合合成酶（DNTAa子qDN鏈A聚需合要酶）

催化，PCR合成DNA子Mg2+催化激；活DNA聚合酶14.PCR中復(fù)制的原料實(shí)際為dNTP（dATP_P_、dTT_T_P、dC_C_TP、d_d_GTP

）除作為原料，還可以水解產(chǎn)生能量為合_成DNA_子_子鏈提供能量的短單鏈核酸結(jié)，因此，PCR反應(yīng)體系中需要添加ATP嗎？不需要

15.引物是一小段能

DNA母鏈

的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)*體內(nèi)復(fù)制的引物為RNA單鏈，PCR中的引物一般為DNA單鏈引物的作用：使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連_接脫氧核苷酸為什么需要引物？DNA復(fù)制不能從頭開始，DNA聚合酶只能從_從引物的3"端延伸DNA_鏈

（DNA聚合酶只能催化單個(gè)核苷酸加到已有核苷酸片段的3_

’端的羥基上）_兩種引物都結(jié)合在DNA模板鏈的

3’

端脫氧核苷酸連接在引物的

3’

端進(jìn)行延伸DNA新鏈延伸的方向?yàn)閺?’端向3’端延伸DNA復(fù)制需要一定的液體環(huán)境和pH，PCR中由緩沖溶液

提供；PCR的過程：目的基因DNA

受熱變性

后解為單鏈

，引物

與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列合；然后以單鏈DN_N_A

為模板在（耐高溫的）DNA聚合酶

作用下進(jìn)行延伸即將4種脫氧核苷酸

加到引物的3’端

，如此重復(fù)循環(huán)多次

。、復(fù)性每次循環(huán)一般可以分為

變性

、延伸

三步）（1）變性①溫度：90_℃以上②具體變化：

雙鏈DNA解聚（解旋）為單鏈

③該過程中打開的是哪種化學(xué)鍵？

氫鍵

（2）復(fù)性①溫度：50_℃左右②具體變化：

兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈D_

NA結(jié)合③該過程堿基互補(bǔ)配對(duì)的一定是引物與模板鏈嗎？不一_定，也可能出現(xiàn)引物與引物配對(duì)（設(shè)_計(jì)問題）、模板鏈配對(duì)

（3）延伸①溫度：72℃左右②具體變化：

4種脫氧核苷酸在耐高溫D_NA聚合_合酶的作用下，

根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原_則合成新的DNA鏈

22.PCR結(jié)果：呈指數(shù)形式擴(kuò)增

（

n次擴(kuò)增循環(huán)后，DNA數(shù)量約為2n為什么呈指數(shù)形式擴(kuò)增？一個(gè)循環(huán)得到的產(chǎn)物可以作為下_下一個(gè)循環(huán)的模板，因而每一次循環(huán)后_后

目的基因的量可以增加一倍

PCR的產(chǎn)物通常采用瓊脂糖凝膠電泳

來鑒定DNA體內(nèi)復(fù)制的條件及作用參與的組分在DNA復(fù)制中的作用DNA母鏈提供DNA復(fù)制的模板4種脫氧核苷酸合成DNA子鏈的原料解旋酶打開DNA雙鏈DNA聚合酶催化合成DNA子鏈引物使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸DNA體外復(fù)制（PCR）的條件及作用參與的組分在DNA復(fù)制中的作用DNA母鏈提供DNA復(fù)制的模板4種脫氧核苷酸合成DNA子鏈的原料引物使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸90℃以上高溫打開DNA雙鏈（變性溫度）耐高溫的DNA聚合酶催化合成DNA子鏈緩沖液（含Mg2+)激活真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶不同的溫度變性、復(fù)性和延伸需要不同溫度PCR與體內(nèi)DNA復(fù)制的比較PCR技術(shù)DNA復(fù)制相同點(diǎn)原則堿基互補(bǔ)配對(duì)條件DNA母鏈作為模板、引物、4種脫氧核苷酸為原料（實(shí)為dNTP）延伸方向新鏈都是從5’端向3’端延伸不同點(diǎn)解旋方式90℃以上高溫解旋解旋酶催化場所體外-PCR擴(kuò)增儀（PCR儀）體內(nèi)-主要在細(xì)胞核延伸用酶耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）DNA聚合酶溫度控制溫度，需要在不同溫度下進(jìn)行（90℃以上變性、50℃左右復(fù)性、72℃左右延伸）體內(nèi)溫和條件過程結(jié)果大量的DNA片段（目的基因）形成完整的子代DNA1.子代DNA分子總數(shù)：

個(gè)；2.第n代產(chǎn)生的DNA數(shù)：_2_n_-1_個(gè)；3.子代DNA脫氧核苷酸鏈總數(shù)=條4.第n代產(chǎn)生的DNA鏈數(shù)：

2n

條復(fù)習(xí)：DNA復(fù)制的相關(guān)計(jì)算假設(shè)復(fù)制培養(yǎng)n代，結(jié)果如下：2n2n+1思考：觀察下列過程，回答問題①n代后，DNA分子有

2n

個(gè)②n代后，DNA鏈有

2n+1

條③第

3

代出現(xiàn)完整的目的基因④n代后，含引物的DNA分子有

2n

個(gè)⑤n代后，共消耗_2_n+__1_-_2_個(gè)引物⑥第n代復(fù)制，消耗了

個(gè)引物⑦n代后，完整的目的基因有_2_n-_2_n_個(gè)2n現(xiàn)學(xué)現(xiàn)用：個(gè)個(gè)“X基因”是DNA分子上一個(gè)有遺傳效應(yīng)的片段,若要用PCR技術(shù)特異性地拷貝“X基因”,需在PCR反應(yīng)中加入兩種引物,兩種引物及其與模板鏈的結(jié)合位置如圖甲所示。經(jīng)4輪循環(huán)后產(chǎn)物中有五種不同的DNA分子,如圖乙所示：第⑤種DNA分子有

8

個(gè)第①②種DNA分子有

2

第③④種DNA分子有

6

思考：用PCR可以擴(kuò)增mRNA嗎？mRNA不可以直接擴(kuò)增，需要將它逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進(jìn)行擴(kuò)增。逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補(bǔ)的DNA鏈，形成RNA-DNA雜交分子；核酸酶H降解RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈，使之變成單鏈DNA；以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補(bǔ)的

DNA鏈，形成雙鏈DNA分子，即cDNA補(bǔ)充內(nèi)容（1）dNTP①dNTP共有四種，堿基處為A、T、G、C分別對(duì)應(yīng)的為

dATP、dTTP、d_G_TP、dCTP

②圖中五碳糖應(yīng)為

脫氧核_核糖

③圖中

②

為脫氧核苷酸現(xiàn)學(xué)現(xiàn)用：有關(guān)DNA分子的研究中，常用32P來標(biāo)記DNA分子。用α、β和γ表示ATP或dATP（d表示脫氧）上三個(gè)磷酸基團(tuán)所處的位置（A-Pα～Pβ～Pγ或dA-Pα～Pβ～Pγ），回答下列問題：某種酶可以催化ATP的一個(gè)磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到DNA末端上，同時(shí)產(chǎn)生ADP，若要用該酶把32P標(biāo)記到DNA末端上，那么帶有32P的磷酸基團(tuán)應(yīng)在ATP的

γ

（填“α”“β”或γ”）位上若用帶有32P標(biāo)記的dATP作為DNA生物合成的原料，將32P標(biāo)記到新合成的DNA分子上，則帶有32P的磷酸基團(tuán)應(yīng)在dATP的α

（填“α”“β”或γ”）位上（2）引物①設(shè)計(jì)引物的依據(jù)是：目的基因兩端的核苷酸序_序列②引物設(shè)計(jì)時(shí)既要考慮目的基因序列，又要考慮載體序列，原因是：

為了便于擴(kuò)增的D_NA片段與表達(dá)載體_體連接，需在引物_物

的5’端加上限制酶的酶切位點(diǎn)

③使用的一對(duì)引物的序列相同嗎？不相同，目的基因兩端具有不同的_的核苷酸序列*兩種引物才能確保DNA的兩條鏈同時(shí)被擴(kuò)增④引物設(shè)計(jì)的要求（或引物失效的原因）每種引物內(nèi)部不能發(fā)生局部堿基互補(bǔ)配對(duì)

兩_兩種引物之間不能_能在局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)

⑤每種引物內(nèi)部不能發(fā)生局部堿基互補(bǔ)配對(duì)的原因防止引物自身折疊_疊⑥兩種引物之間不能在局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)的原因防止引物之間配對(duì)_對(duì)，導(dǎo)致引物不能_能同模板鏈結(jié)合⑦兩種引物都結(jié)合在DNA模板鏈的3’端脫氧核苷酸連接在引物的

3’

端進(jìn)行延伸⑧引物長度一般為_2_0_-_3_0_個(gè)核苷酸，若引物長度過短，則引物與模板鏈結(jié)合的特異性較_較差現(xiàn)學(xué)現(xiàn)用：若想獲得以下已知序列的DNA片段，設(shè)計(jì)了一些PCR引物，應(yīng)選用的PCR引物是

③①

(從引物①②③④中選)DNA序列(虛線處省略了部分核苷酸序列)已知序列PCR引物①5′AACTATGCGCTCATGA3′②5′GCAATGCGTAGCCTCT3′③5′AGAGGCTACGCATTGC3′④5′TCATGAGCGCATAGTT3′現(xiàn)學(xué)現(xiàn)用：若如表所列為已知的DNA序列和設(shè)計(jì)的一些PCR引物，若想獲得未知序列，選用的PCR引物應(yīng)是

②④

基因文庫分為兩類：基因組文庫

和_部分基因文庫（如cDNA文庫）cDNA文庫比基因組文庫小

；cDNA文庫中的基因

_無

啟動(dòng)子、終止子和內(nèi)含子；基因組文庫中的基因

有

啟動(dòng)子、終止子和內(nèi)含子；cDNA概念：某種生物發(fā)育的某個(gè)時(shí)期的mRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的多種互補(bǔ)DNA片段；形成cDNA的過程中需要逆轉(zhuǎn)錄

酶；真核生物的cDNA為什么沒有內(nèi)含子和啟動(dòng)子？cDNA是由生物發(fā)育的某個(gè)時(shí)期的m_

RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的DNA片段，啟動(dòng)子位于_非編碼區(qū)，不會(huì)轉(zhuǎn)錄形成mRNA的片段，而內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄之后，會(huì)經(jīng)后期加_工，其對(duì)應(yīng)的RNA序列會(huì)被剪切掉，因此在m_

RNA中不含有啟動(dòng)子和內(nèi)含子_對(duì)應(yīng)的RNA序列，那么經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄得到的D_

NA_中，也就沒有相應(yīng)的序列為什么cDNA文庫中含有的基因數(shù)目比基因組文庫中的少？cDNA文庫中只含有該生物在某個(gè)時(shí)期已表達(dá)的基因，而基因組文庫中含_有該生物的全部基因_利用化學(xué)方法合成DNA需要儀器為DNA合成儀

；要求基因的核苷酸序列

已知

；該過程

不需要

模板；補(bǔ)充內(nèi)容：基因的結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動(dòng)子編碼區(qū)原核生物基因終止子轉(zhuǎn)錄mRNA加工轉(zhuǎn)錄mRNA前體成熟mRNA真核細(xì)胞的基因編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)外顯子內(nèi)含子12345非編碼區(qū)啟動(dòng)子非編碼區(qū)終止子補(bǔ)充內(nèi)容：基因的結(jié)構(gòu)基因表達(dá)載體的構(gòu)建地位：基因表達(dá)載體的構(gòu)建這一步是基因工程的核心

工作操作目的*：讓目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)_定存在，并且遺傳給下一代，同時(shí)，_使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用等3.基因表達(dá)載體的組成*：基因表達(dá)載體必須包括目的基因、標(biāo)記基因

、啟動(dòng)子

、終止子_（若需要能完成自主復(fù)制，還應(yīng)有

復(fù)制原點(diǎn)

）4.啟動(dòng)子①本質(zhì)：一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DN_N_A

片段②位置：

位于基因的上游，緊挨轉(zhuǎn)錄_的起始位點(diǎn)

③功能*：

RNA聚合酶識(shí)_別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA

④特殊類型：誘導(dǎo)型啟動(dòng)子⑤誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的特點(diǎn)當(dāng)誘導(dǎo)物存在_在時(shí)，可以激活或抑制目的基因的表達(dá)_達(dá)

5.終止子①本質(zhì)：一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的_D_N_A_片段②位置：位于基因的下游

③功能*：

使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來_來

等6.標(biāo)記基因①作用：

便于重組DNA分子的篩選

②常見類型抗生素抗性基因_

、熒光蛋白基_因7.基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程①首先會(huì)用一定的

限制酶

切割載體，使它出現(xiàn)一個(gè)切口

；②然后用同種限制酶或能產(chǎn)生相同末_端的限制酶切割含目的基因_的DNA片段（使之產(chǎn)生

平末端或相同的黏性末端

）；③再利用

DNA連接酶

處，這樣就形將目的基因片段拼接到載體切口成了一個(gè)重組DNA分子

；8.切割載體和切割含有目的基因的DNA片段的限制酶符合什么條件為什么？應(yīng)為同種限制酶或能產(chǎn)生相同末_末端的限制酶

產(chǎn)生相同的黏性末端或平末端，_，以便通過DNA連接酶連接

9.用同一種限制酶切割質(zhì)粒和含有目的基因的DNA，再用DNA連接酶處理后，一定會(huì)形成重組DNA分子嗎？不一定，載體和目的基因都可能_能出現(xiàn)自身環(huán)化

用同一種限制酶切割質(zhì)粒和含有目的基因的DNA，再用DNA連接酶處理后，可能有幾種產(chǎn)物（只考慮兩兩連接）？_三種：載體-載體、目的基_因-目的基因、載體-目的基因用同一種限制酶切割質(zhì)粒和含有目的基