生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程及厭氧菌的培養(yǎng)方法

厭氧菌的培育方法厭氧菌在有氧的狀況下不能生長。

要培育厭氧菌,必需制造一個(gè)無氧的環(huán)境。

通常用培育基中參與復(fù)原劑,或用物理、化學(xué)方法去除環(huán)境中的游離氧,以降低氧化復(fù)原電勢。

如皰肉培育基、硫基乙酸鈉培育基,牛心腦浸液培育基等。

常用的厭氧培育方法有許多,可依據(jù)實(shí)際狀況選用。

厭氧缸法接種好標(biāo)本的平板或液體培育基試管,可放入?yún)捬醺變?nèi)培育,厭氧缸是一般的枯燥缸,用物理化學(xué)的方法使缸內(nèi)造成厭氧環(huán)境,從而將厭氧菌培育出來。

厭氧袋〔-〕即在塑料袋內(nèi)造成厭氧環(huán)境來培育厭氧菌。

塑料袋透亮而不透氣,內(nèi)裝氣體發(fā)生管〔有硼氫化鈉的碳酸氫鈉固體以及5%檸檬酸安瓿〕、美蘭指示劑管、鈀催化劑管、枯燥劑。

放入已接種好的平板后,盡量擠出袋內(nèi)空氣,然后密封袋口。

先折斷氣體發(fā)生管,后折斷美蘭指示劑管,命名袋內(nèi)在半小時(shí)內(nèi)造成無氣環(huán)境。

如不突變表示袋內(nèi)已達(dá)厭氧狀態(tài),可以孵育。

厭氧手套箱〔〕是迄今為止國際上公認(rèn)的培育厭氧菌最正確儀器之一。

它是一個(gè)密閉的大型金屬箱,箱的前面有一個(gè)有機(jī)玻璃做的透亮面板,板上裝有兩個(gè)手套,可通過手套在箱內(nèi)進(jìn)展操作,故名。

箱側(cè)有一交換室,具有內(nèi)外二門,內(nèi)門通箱內(nèi)先關(guān)著。

欲放物入箱,先翻開外門,放入交換室,關(guān)上外門進(jìn)展抽氣和換氣〔2,2,2〕到達(dá)厭氧狀態(tài),然后手伸入手套把交換室內(nèi)門翻開,將物品移入箱內(nèi),關(guān)上內(nèi)門。

箱內(nèi)保持厭氧狀態(tài),也是利用充氣中的氫在鈀的催化下和箱中錢剩余氧化合成水的原理。

該箱可調(diào)整溫度,本身是孵箱或孵箱即附在其內(nèi),還可放入解剖顯微鏡便于觀看厭氧菌菌落,這種厭氧箱適于作厭氧細(xì)菌的大量培育爭辯,大量培育基可放入作預(yù)復(fù)原和厭氧性無菌試驗(yàn)。

金屬硬壁型厭氧箱的抽氣、充氣、厭氧環(huán)境和溫度等均系自動調(diào)整。

厭氧盒:原理同厭氧袋,有成品銷售。

生物耗氧法:在一密閉的容器內(nèi)放以生物〔多是植物〕,消耗氧氣,同時(shí)產(chǎn)生二氧化碳,供細(xì)菌生長用。

我沒見過。

焦性末食子酸法:在一潔凈的玻片上鋪上紗布或?yàn)V紙,勻稱撒上焦性末食子酸,然后再混入3粉末或溶液,快速將已接種細(xì)菌的平板倒扣在上面,用溶化的白蠟封邊,造成一個(gè)封閉空間。

焦性末食子酸與堿反響后耗氧。

該法用于厭氧不嚴(yán)格的厭氧菌的培育,簡潔。

如有梭狀芽孢桿菌。

皰肉培育基:本身就是一個(gè)不需特殊設(shè)備的厭氧培育法。

皰肉和肉湯裝入大試管,液面封凡士林,造成無氧環(huán)境。

產(chǎn)氣莢膜梭菌〔魏氏梭菌〕取自氣性壞疽病人膿液的革蘭染色,顯示粗的磚形革蘭陽性桿菌。

〔革蘭染色,放大1000倍〕破傷風(fēng)梭菌,革蘭染色破傷風(fēng)梭菌是細(xì)的末端有芽胞的革蘭陽性桿菌。

芽胞中心不染氏。

〔革蘭染色,放大1000倍〕生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程生物制品不得含有雜菌〔有特地規(guī)定者除外〕,滅活菌苗、疫苗不得含有活的本菌、本毒。

在制造過程中應(yīng)由制造部門按各制品制造及檢定規(guī)程規(guī)定進(jìn)展無菌試驗(yàn),分裝后的制品須經(jīng)質(zhì)量檢定部門做最終檢定。

各種生物制品的無菌試驗(yàn)除有特地規(guī)定者外,均應(yīng)依據(jù)本規(guī)程的規(guī)定進(jìn)展。

抽樣原液及半成品原液及半成品應(yīng)每瓶分別進(jìn)展無菌試驗(yàn),%,。

大罐稀釋的制品抽樣數(shù)量不得少于10。

原液及半成品每開瓶一次,應(yīng)如上法抽驗(yàn)。

成品每亞批均應(yīng)進(jìn)展無菌試驗(yàn),樣品應(yīng)隨機(jī)抽取,應(yīng)具有代表性〔包括分裝過程的前、中、后樣品〕。

〔瓶〕或以下者抽檢不少于5支,101~500支〔瓶〕者抽檢不少于10支〔瓶〕,501~10000支〔瓶〕者抽檢不少于20支〔瓶,10001支〔瓶〕以上者抽檢40支〔瓶〕。

,每柜凍干200瓶以下者抽檢2瓶,200瓶及以上者抽檢4瓶。

6~20抽檢量加倍。

。

凡規(guī)定需作支原體檢查的制品,均應(yīng)在半成品時(shí)按亞批進(jìn)展檢查,成品可不再做。

無菌試驗(yàn)用培育基〔培育基處方可附錄1〕檢查制品中本菌是否存活應(yīng)承受適于本菌發(fā)育生長的培育基〔在半成品時(shí)檢查,有特地規(guī)定者除外〕。

檢查需氧性和厭氧性雜菌應(yīng)承受硫乙醇酸鹽培育基。

檢查不含***類防腐劑制品中的需氧性和厭氧性雜菌時(shí),該培育基中可不加硫乙醇酸鹽。

檢查霉菌和腐生菌應(yīng)承受改進(jìn)馬丁培育基。

檢查混濁制品可承受不含瓊脂的硫乙醇酸鹽培育基。

檢查活菌苗時(shí)可加大瓊脂含量,做成斜面。

檢查支原體應(yīng)承受豬胃消化液半固體或牛心消化液半固體培育基。

生物制品無菌試驗(yàn)用培育基亦可用經(jīng)檢定合格的枯燥培育基配制。

無菌試驗(yàn)培育基的靈敏度,乙型溶血性鏈球菌〔32210株〕應(yīng)到達(dá)10-8,短芽胞桿菌〔7316株〕和生孢子梭狀芽胞桿菌〔64941株〕應(yīng)到達(dá)10-7,白色念珠菌〔10231〕和臘葉芽枝霉應(yīng)到達(dá)10-。

6生物制品無菌試驗(yàn)培育基由質(zhì)量檢定部門與培育基制造部門會同進(jìn)展靈敏度試驗(yàn)。

每當(dāng)更換主要原材料時(shí),應(yīng)進(jìn)展靈敏度試驗(yàn),合格前方可應(yīng)用〔靈敏度試驗(yàn)法見附錄2、3〕。

各生產(chǎn)單位的質(zhì)量檢定部門應(yīng)定期抽檢無菌試驗(yàn)培育基的靈敏度,檢定所應(yīng)定期抽檢各所的無菌試驗(yàn)培育基。

無菌試驗(yàn)方法無菌試驗(yàn)取樣、移種等全部操作,應(yīng)在無菌操作室內(nèi)或無菌條件下進(jìn)展,無菌操作室應(yīng)經(jīng)常保持清潔,在每次操作前,應(yīng)徹底消毒。

菌苗、疫苗、類***、抗***類制品及粘稠不易過濾的血液制品應(yīng)用直接接種法進(jìn)展無菌試驗(yàn)。

人白蛋白及人丙種球蛋白〔包括各種劑型及應(yīng)用途徑的制品〕應(yīng)用薄膜過濾法進(jìn)展無菌試驗(yàn),其他血液制品亦可用薄膜過濾法或直接接種法進(jìn)展。

直接接種法菌苗、疫苗、類***、抗***〔〕,〔〕,,全部吸取。

含防腐劑的制品,接種量與培育基的比例:用苯酚或***仿作防腐劑者至少為1:20,用***作防腐劑者或制品內(nèi)含有甲醛、抗生素者至少為1:50。

先按此比例接種于硫乙醇酸鹽培育基內(nèi)增菌,于20~25℃培育3~4天后移種至硫乙醇酸鹽培育基、相宜的瓊脂斜面、改進(jìn)馬丁培育基各2管,。

將硫乙醇酸鹽培育基、相宜的瓊脂斜面各1管置30~35℃培育,其余各管置20~25℃培育,培育時(shí)間除有特地規(guī)定者外共為8天。

不含防腐劑制品,〔〕每10支安瓿混合,,將混合后的樣品直接接種一組培育基,分別置20~25℃、30~35℃培育,培育時(shí)間共為8天。

支原體培育基臨用時(shí)將半固體煮沸10~15分鐘后,冷卻到56℃左右,參與未滅能馬血清或滅能小牛血清和酵母浸液〔培育基、血清、酵母浸液之比為7:2:1〕,并可酌情參與適量青霉素或***,充分搖勻,等冷至35~37℃~,共接種2支培育基,置35~37℃培育14天。

混濁和接種后不能判定結(jié)果的制品,可取規(guī)定量的樣品接種于不含瓊脂的硫乙醇酸鹽培育基〔200〕內(nèi)進(jìn)展增菌培育,3~4天后移種。

培育基種類和支數(shù)、,共培育8天后判定結(jié)果。

血液制品取規(guī)定抽樣數(shù),按以下規(guī)定,從每瓶抽取樣品,并全部接種完。

,抽取全量,1~20以下者〔不含20〕,,每支裝量為15的培育基,。

樣品每瓶裝量以下者〔不含〕,100及以上者按15%抽樣,每支裝量為40的培育基,。

應(yīng)接種的培育基支數(shù)依取樣的總量而定。

接種硫乙醇酸鹽培育基與改進(jìn)馬丁培育基支數(shù)之比為2:1。

接種后將硫乙醇酸鹽培育基總支數(shù)的12置30~35℃培育,其余置20~25℃培育,改進(jìn)馬丁培育基置20~25℃培育,培育時(shí)間不少于14天。

~。

取規(guī)定抽檢樣品數(shù),每瓶裝量100及100以下者取全量,100以上者取半量參與滅菌薄膜過濾器內(nèi),加壓或減壓過濾。

如為含***防腐劑者,在樣品過濾后,應(yīng)用滅菌生理鹽水或其他相宜溶劑沖洗濾膜3次,每次100。

過濾后,無菌取出濾膜,分別放入硫乙醇酸鹽培育基2支及改進(jìn)馬丁培育基1支〔每支裝量不少于40,高度不得低于7〕。

假設(shè)使用一個(gè)過濾裝置,則將該膜剪成三等分,分別放入規(guī)定培育基中。

將濾膜放入培育基后,一支硫乙醇酸鹽培育基置30~35℃培育,其余各支培育基置20~25℃培育。

培育時(shí)間不少于7天。

最好承受全封閉式一次性微孔過濾集菌器,要求每支培育器培育裝量為100。

檢查厭氧性雜菌用培育基需加熱驅(qū)氧者,必需冷卻到45℃以下再行接種。

凍干制品按使用說明書或瓶簽規(guī)定的稀釋量稀釋后進(jìn)展無菌試驗(yàn)。

判定無雜菌生長判為合格〔有特地規(guī)定者除外〕。

無菌試驗(yàn)覺察