Survivin基因真核表達載體的構建及其在cos【摘要】［目的］克隆人survivin基因并在真核細胞中表達。［方法］以人喉癌組織中提取總RNA為模版，采用反轉錄聚合酶鏈RT-PCR法獲得survivincDNA。將該基因克隆到載體中,構建真核細胞表達載體/survivin，將測序正確的survivin基因通過脂質體介導下轉染cos-7，Westernblot檢測survivin蛋白在cos-7中表達。［結果］DNA測序證明獲得了survivin基因，其序列與GeneBank中報道序列完全一致。Westernblot檢測survivin蛋白獲得高效表達，其相對分子質量為。［結論］Survivin基因的克隆和表達均獲得了成功，為進一步探討survivin基因在喉癌診治中應用奠定了基礎。

【關鍵詞】survivin基因人喉癌組織基因表達

ConstructionofSurvivinEukaryoticExpressionVectorandItsExpressionincos-7

Abstract:［Purpose］Tocloneandexpresshumansurvivingenewitheukaryoticvector.［Methods］TotalmRNAwasextractedfromhumanlaryngealcancertissue,andthenthefull-lengthsurvivincDNAwasobtainedbyRT-PCR.Thesurivingenewasclonedintovectorandthe/survivinvectorwasconstructedandtransfectedintocos-7cells.Thesurvivinproteinwasanalyzedbywesternblot.［Results］ThecDNAofsurvivinwassequencedandconsistentwiththesequencereportedinGenebankwithblast。Westernblotanalysisdemonstratedthatthesurvivinproteinwasexpressedandtherelativedmolecularmasswasabout［Conclusions］survivingenehasbeenclonedandexpressedsuccessfullyandcanbeusedforfurtherstudytheapplicationsofsurvivinondiagnosisandtherapyinthelaryngealcancer.

Keywords:survivingene;eukaryoticexpression;vectorconstruction

Survivin是近年來發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白(inhibitorofapoptosisproteins，IAP)家族的成員，其功能主要通過抑制Caspase-3和Caspase-7的活性而阻斷細胞凋亡過程。該蛋白選擇性地表達于胚胎發(fā)育組織和人類大多數(shù)腫瘤組織，而正常成人終末組織中不表達，其獨特的分布特點在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的重要作用已受到學者們的廣泛關注。為了進一步探討該基因在人喉癌組織中的表達及其在喉癌診斷及預后判斷中的作用，我們構建了survivin基因的真核表達載體并將其轉染cos-7細胞以觀察該基因在其中的表達情況，為下一步喉癌的診斷和治療提供新的理論依據(jù)。

1材料與方法

材料

人新鮮喉癌組織、質粒和猴成纖維細胞cos-7細胞系及DH5α菌株均為本科保存。限制性內(nèi)切酶及胰蛋白酶購于寶生物工程(大連)有限公司；T4DNA連接酶、DNA純化試劑盒和逆轉錄試劑盒購于Promega公司，用于組織總RNA提取的TripureIsolationReagent提取試劑盒購于Gibco公司。轉染試劑LipofectamineReagent2000和G418購于Gibco公司，survivin兔抗人多克隆抗體購自于Santacruz公司。

方法

PCR引物設計

根據(jù)GeneBank中survivin序列，設計一對引物，P1(survivin基因上游引物，5′GCCGGTACCATGGGTGCCCCGACG；3′P2(survivin基因下游引物，5′GCCCTCGAGTCAATCCATGGCAGC3′。在上游和下游引物5′端分別加入了BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點，以便于克隆。引物由上海博亞生物有限公司合成。

目的基因survivin片段的獲得

取手術切除的人新鮮喉癌組織，機械搗碎后，消化收集、洗滌、沉淀，以TripureIsolationReagent總RNA試劑提取總RNA(詳見試劑操作說明)，按產(chǎn)品說明書操作，以反轉錄體系經(jīng)RT-PCR制備survivincDNA，反應如下:取總RNA1μｇ，oligadT2μl，混勻后70℃10min，冰浴2min后加5倍逆轉錄緩沖液5μl，10mmol/LdNTP2μl，RNA酶抑制劑2μl，逆轉錄酶(MLVRT)40Ｕ，混勻后42℃水浴60min，冰浴2min，70℃加熱10min后模板制備完畢。以所制備survivincDNA為模板進行35個PCR反應擴增，反應體系如下:模板cDNA8μl，10倍緩沖液10μl，25mmol/LMgCl210μl，上、下游引物(10ｐｍｏｌ/Ｌ)4μl，TagDNA聚合酶2μl，10mmol/LdNTP2μl，加Ｈ2Ｏ補足至總體積100μl。反應條件為:94℃5min，52℃2min，72℃2min后94℃1min，52℃1min，72℃2min，35個循環(huán)，最后72℃繼續(xù)延伸10min。取5μlPCR產(chǎn)物，在含/Ｌ溴化乙錠(EB)的瓊脂糖凝膠(15ｇ/Ｌ)中電泳分析，紫外觀測儀觀察結果。

Survivin基因的克隆及真核載體/survivin的構建

回收純化的產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切并回收,取10μl回收片段，加經(jīng)BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切的質粒2μl，加T4DNA連接酶1μl、10×bufferＤ2μl、雙蒸水5μl，4℃過夜進行連接，構建重組質粒，命名為/survivin。取連接產(chǎn)物10μl轉化感受態(tài)細胞DH5α100μl，與ＬＢ培養(yǎng)液混勻,倒入含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，用涂菌棒均勻涂平，置37℃孵箱過夜。用牙簽隨機挑取單個菌落，置搖菌管中，37℃恒溫振蕩器搖菌16ｈ。移菌液至離心管中，離心棄上清,按試劑盒說明書介紹進行質粒的抽提和純化。同時取1ml菌種送上海生工測序。抽提純化的重組質粒4μl，加10×bufferＤ1μl，BamHⅠ和XhoⅠ各μl，雙蒸水4μl，置37℃恒溫箱進行酶切1ｈ，進行瓊脂糖凝膠電泳。

細胞轉染及穩(wěn)定轉染細胞系的建立

cos-7細胞在含100ml/Ｌ新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至70%左右，在脂質體介導下將重組質粒/survivin進行轉染，具體方法參照轉染試劑說明書進行。Ｇ418(濃度為500μｇ/ml)篩選。

Westernblot印跡

分別取3×107個穩(wěn)定轉染空載體(+)及重組質粒/survivin的cos-7細胞，裂解后加入3×加樣緩沖液混勻，沸水中煮10min，離心，經(jīng)15%的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后，在轉移槽中將蛋白從凝膠中的蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上(電壓14Ｖ，冷室內(nèi)過夜)，麗春紅染液預染并標記蛋白分子量。TBST緩沖液洗膜、封閉過夜。加TBST緩沖液稀釋的兔抗人survivin多克隆抗體(1∶200)作為一抗，37℃孵育15ｈ，加堿性磷酸酶標記IgG(1∶400)作為二抗，孵育、洗膜后，將膜浸入10ml堿性磷酸酶底物緩沖液與33μｌ四唑氮藍(NBT)和66μｌ(BCIP)制成的顯色液，室溫閉光顯色20min，蒸餾水終止反應。

2結果

Survivin基因的獲得與鑒定

以逆轉錄合成的cDNA為模板進行PCR擴增，PCR電泳結果顯示一條約為425ｂｐ大小的特異性條帶。此DNA帶與survivin基因的大小相符合(425ｂｐ)，圖中未見有其他非特異擴增帶出現(xiàn)(圖1)。將該DNA帶回收后，DNA測序結果表明，經(jīng)逆轉錄PCR獲得的DNA片段為survivin基因，其DNA序列與GeneBank中報道的survivin基因序列吻合。

Survivin基因的克隆及真核表達載體/survivin的酶切結果

Survivin基因插入表達載體后，提取獲得的重組質粒/survivin，以雙酶切鑒定，鑒定結果發(fā)現(xiàn)其中有一425bp的條帶為轉染基因survivin產(chǎn)物。

Survivin蛋白表達

將正確的重組菌在37℃活化過夜，經(jīng)IPTG誘導表達后做SDS分析，從電泳圖可以看出在表達蛋白理論相對分子質量(×103)對應處出現(xiàn)了一條新的表達帶。

3討論

近年來已陸續(xù)有文獻報道survivin蛋白在頭頸部腫瘤組織中的表達[1~3]，本文通過分子生物學方法克隆擴增喉癌組織中survivin基因，構建真核表達載體，并轉染cos-7細胞，為下一步研究survivin基因并探索腫瘤的生物治療奠定基礎。

Survivin是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的凋亡抑制因子，屬于凋亡抑制蛋白家族的新成員，是迄今發(fā)現(xiàn)最強的一種凋亡抑制蛋白，主要通過抑制Caspase-3和Caspase-7的活性而阻斷細胞凋亡過程，而且能在細胞有絲分裂前期通過與紡錘體微管發(fā)生特異性結合反應，使腫瘤細胞逃避細胞周期Ｇ2/Ｍ期檢測點的監(jiān)控，抵抗因DNA損傷和突變自身誘導的細胞凋亡，從而導致腫瘤細胞異常分裂增殖。Survivin主要表達于胚胎和發(fā)育的胎兒組織，同時高表達于多種腫瘤組織和轉化細胞，在成人各種正常器官中檢測不到。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌、前列腺癌、乳腺癌、子宮頸癌、口腔鱗癌、鼻咽癌和造血系統(tǒng)腫瘤中survivin均過度表達[5，6]。由于survivin僅特異性地表達于腫瘤組織，在正常成人組織幾乎不表達，使得應用survivin特異性抗體作免疫治療、決定基因突變以及反義survivin基因治療具有良好的靶向性、特異性及安全性，具有成為喉癌治療的潛在新靶點[7，8]。

我們以人喉癌組織總RNA為模板，擴增survivin基因，插入原核表達載體，成功地表達了survivin蛋白。不僅證實了survivin在喉癌組織中有表達，而且為進一步研究其在喉癌及其他惡性腫瘤的診斷、靶向性治療及預后判斷中的應用意義奠定了基礎。

但有關survivin促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展的許多環(huán)節(jié)還不清楚。隨著對survivin研究的進一步深入，survivin在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用機制必將進一步闡明，而survivin的靶向腫瘤療法及針對性開發(fā)新的抗腫瘤藥物對腫瘤的治療將具有深遠的意義。

【參考文獻】

[1]SalzW,EisenbergD,PlesciaJ.Asurvivingenesignaturepredictsaggressivetumorbehavior[J].CancerRes,2005,65(9):3531-3534.

ZhuJ,XuRJ,WuZH,etal.Expressionofsurvivingeneanditsrelationshipwithexpressionofp15,p16proteinsinlaryngealsquamouscellcarcinomas[J].ZhonghuaErBiYanHouKeZaZhi,2004,9(6):356-359.

BadranA,YoshidaA,IshikawaK,etal.Identificationofanovelsplicevariantofthehumananti-apoptopsisgenesurvivin[J].BiochemBiophysResCommun,2004,314(3):902-907.

PisarevV,YuB,SalupR.Full-lengthdominant-negativesurvivinforcancerimmunotherapy[J].ClinCabcerRes,2003,9(17):6523-6533.

AltieriDC.Validatingsurvivinasacancertherapeutictarget[J].NatRevCancer,2003,3(1):46-54.

NasuS,YagihashiA,IzawaA,etal.SurvivinmRNAexpressioninpatientswithbreastcancer[J].AnticancerRes,2002,22(3):1839-1843.

CalderonAJ,LavergneJA.RNAinterference:anovelandp