考氏科薩氏菌產(chǎn)酶條件優(yōu)化及酶活性質(zhì)初步研究

c.3.1.73，肉桂酸酯酶或肉桂枝酸酯酶，可分為抗膽紅素、糖乙酸酯和低聚糖亞硝酸鹽，屬于水楊酸酯水解酶的亞類。阿魏酸又名4-羥基-3-甲氧基肉桂酸，是一種存在于許多植物細(xì)胞壁中的一種重要的酚酸物質(zhì)，如高粱、蘆根、麥稈、麥麩、米糠、玉米皮、洋蔥皮、發(fā)酵茶等植物細(xì)胞壁中，具有抗氧化、抗血栓、抗輻射、抗血小板凝集、改善心腦血管健康、對老年人具有恢復(fù)和改善記憶等功能國外沒有固態(tài)發(fā)酵的釀制白酒方式，因此對白酒中阿魏酸的研究較少。國內(nèi)目前對阿魏酸的研究主要集中在飼料、紡織、造紙、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、生物能源等領(lǐng)域。隨著我國國民收入水平的提高，人們對生活質(zhì)量的要求也越來越高，在保障白酒安全生產(chǎn)的同時還要讓白酒有益于消費(fèi)者的健康，健康飲酒已經(jīng)成為中國白酒的新趨勢。利用科技力量，剖析傳統(tǒng)工藝白酒中的成分以及找尋天然植物中的健康成分。本試驗以前期從濃香型白酒釀造過程中篩選出的一株產(chǎn)阿魏酸酯酶菌株考氏科薩克氏菌（Kosakoniacowanii）為研究對象，對產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，并研究該菌株產(chǎn)阿魏酸酯酶酶活性質(zhì)及在麩皮、糟醅和大曲中的發(fā)酵應(yīng)用。本研究旨在為之后研究提高白酒中的阿魏酸含量奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料和試劑1.1.1菌株和材料考氏科薩克氏菌（Kosakoniacowanii）：本實驗室保存；大曲、糟醅：瀘州某酒廠；麩皮：市售。1.1.2化學(xué)試劑NaCl、瓊脂粉、（NH1.1.3培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基：（NH1.2試驗設(shè)備及設(shè)備LS-28HD立式壓力蒸汽滅菌器：江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；TGL-16M離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺：上海滬凈醫(yī)療器械有限公司；HWS-260A恒溫恒濕培養(yǎng)箱：杭州綠博儀器有限公司；SPH-1102恒溫?fù)u床：上海世平試驗設(shè)備有限公司；T6新世紀(jì)紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；1200型高效液相色譜（highperformanceliquidchromatography,HPLC）儀：美國Agilent公司。1.3方法1.3.1粗酶液的制備菌株Kosakoniacowanii以1%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于180r/min、32℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)72h，發(fā)酵完后取9mL發(fā)酵液在轉(zhuǎn)速為10000r/min、4℃條件下離心10min，保留上清液，即獲得粗酶液。1.3.2相對酶活性的測定(1）酶的最適溫度及穩(wěn)定性取2mL緩沖液（pH6.0）于試管中，加入2mL1mmol/L阿魏酸甲酯溶液，分別放置于溫度為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的水浴鍋中反應(yīng)5min，再分別加入1mL酶液，水浴20min，沸水滅酶終止反應(yīng)，混勻后以對照組為空白（失活的酶液）測定波長320nm處的吸光度值，以酶活最高者為100%，計算相對酶活性將粗酶液分別放置于溫度為30℃、40℃、50℃、60℃的水浴鍋中保溫50min，每隔10min檢測一次酶活性，統(tǒng)一在50℃水浴鍋中反應(yīng)。以各溫度的初始酶活為100%，計算相對酶活性。(2）酶的最適pH及穩(wěn)定性取2mL緩沖液（pH2.6、3.2、3.8、4.4、5.0、5.6、6.2、6.8、7.4、8.0）于試管中，加入2mL1mmol/L阿魏酸甲酯溶液，置于50℃水浴鍋中反應(yīng)5min，再分別加入1mL酶液，在50℃水浴鍋中反應(yīng)20min，沸水終止反應(yīng)，混勻后以對照組為空白（失活的酶液）測定波長320nm處的吸光度值，以酶活最高者為100%，計算相對酶活性。配制不同pH(3.2、3.8、4.4、5.0、5.6、6.2、6.8、7.4、8.0）緩沖液，與粗酶液等量混合，在4℃冰箱中放置2h，測定剩余酶活，以各pH值的初始酶活為100%，計算相對酶活。1.3.3初始ph值、溫度對產(chǎn)酶的影響菌株Kosakoniacowanii預(yù)先進(jìn)行活化，以接種量分別為0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、6.0%接種到培養(yǎng)基中，裝液量分別為30mL/250mL、60mL/250mL、90mL/250mL、120mL/250mL、150mL/250mL，初始pH值分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0，分別置于溫度為28℃、31℃、34℃、37℃、40℃的搖床中，180r/min培養(yǎng)72h，檢測酶活，考察不同接種量、裝液量、初始pH值、溫度對酶活的影響，每個試驗設(shè)置3個平行樣。1.3.4阿魏酸酯酶活測定法(1）阿魏酸酯酶酶活檢測檢測方法：取9mL發(fā)酵液10000r/min離心10min，取上清液，即獲得粗酶液。取2mL阿魏酸甲酯溶液和2mL檸檬酸緩沖液（pH6.0）在溫度為50℃水浴鍋中水浴5min，再加入1mL粗酶液，反應(yīng)20min，沸水滅酶終止反應(yīng)，以煮沸失活的酶液為空白，在波長320nm條件下測定溶液吸光度值。阿魏酸酯酶酶活定義：1mL酶液在50℃、pH6.0條件下，每分鐘酯解阿魏酸甲酯，生成1μmol阿魏酸所需酶量定義為1個酶活力單位（U/mL）。(2）阿魏酸檢測檢測方法：在糟醅、大曲和麩皮三角瓶中加入體積分?jǐn)?shù)70%甲醇，所加體積分別為45mL、55mL、80mL，放置于溫度為30℃、180r/min的搖床中搖30min，然后10000r/min離心10min，獲得上清液，將上清液用0.22μm濾膜過濾，進(jìn)行HPLC分析。并按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=-8.6333+53.9604x(R色譜條件：ZORBAXSB-Aq色譜柱（4.6mm×250mm,5μm），紫外檢測器，檢測波長320nm，柱溫25℃，流動相為甲醇和5%醋酸（25∶75,V/V），流速1mL/min，進(jìn)樣量10μL1.3.5阿魏酸含量測定麩皮與水的料液比為1∶1(g∶mL），將稱好的麩皮放入盆中，加水拌勻，稱取40g裝入三角瓶中，共8瓶，滅菌。將菌株進(jìn)行活化，以3%的接種量接種到滅菌的麩皮中，放置于溫度為34℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行有氧發(fā)酵，每天檢測阿魏酸含量，空白組為不加菌的麩皮。設(shè)置3個平行。(2）糟醅發(fā)酵稱取45g糟醅加入已滅菌的三角瓶中，用保鮮膜封口，共15瓶，分為兩組，一組為實驗組，共7瓶，一組為對照組，每組8瓶。將菌株進(jìn)行活化，以3%的接種量接種到實驗組中，將實驗組和對照組都放置于溫度為34℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行厭氧發(fā)酵，每天檢測阿魏酸含量，對照組不加菌。設(shè)置3個平行。(3）大曲發(fā)酵稱取35g大曲加入已滅菌的三角瓶中，共15瓶，分為兩組，一組為實驗組，共7瓶，一組為對照組，每組8瓶。將菌株進(jìn)行活化，以3%的接種量接種到實驗組中，將實驗組和對照組都放置于溫度為34℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行有氧發(fā)酵，每天檢測阿魏酸含量，對照組不加菌。設(shè)置3個平行。1.3.6數(shù)據(jù)處理及分析試驗結(jié)果采用平均值±標(biāo)注誤差表示，使用SPSS22.0進(jìn)行單因素方差分析，并采用Duncan檢驗法進(jìn)行多重比較，以P<0.05作為差異性顯著判斷標(biāo)準(zhǔn)。2結(jié)果與分析2.1發(fā)酵生酶條件優(yōu)化2.1.1裝液量對產(chǎn)酶的影響由圖1可知，培養(yǎng)基裝液量對酶活是有影響的，當(dāng)裝液量為30～90mL/250mL時，隨著裝液量的增加而增加；裝液量達(dá)到90mL/250mL時，酶活最大，為28.27U/L；當(dāng)裝液量>90mL/250mL后酶活逐漸減小。因此，最適裝液量為90mL/250mL。2.1.2初始ph值對產(chǎn)酶的影響由圖2可知，培養(yǎng)基的初始pH值對于微生物的生長和產(chǎn)酶都有一定的影響。不同的初始pH對菌株產(chǎn)酶是有影響的，該菌株在初始pH值為5.0～8.0范圍下均能產(chǎn)酶，在初始pH值為5.5時，酶活最大，約為27.34U/L。隨著初始pH值的增大，酶活呈遞減趨勢。因此，最適初始pH值為5.5。2.1.3著接種量對產(chǎn)酶的影響由圖3可知，不同的接種量對酶活是有影響的，隨著接種量在0.5%～4.0%范圍內(nèi)的提高，酶活隨之增高，當(dāng)接種量為4%，酶活最高，為27.12U/L；當(dāng)接種量>4%后，酶活減少。2.1.4著溫度3232時，各保鮮液酶的增殖由圖4可知，溫度的變化影響酶活的大小，隨著溫度在28～34℃范圍內(nèi)的升高，酶活呈遞增趨勢，當(dāng)溫度為34℃時，酶活最高；當(dāng)溫度>34℃后隨著溫度的升高，酶活呈遞減趨。2.1.5初始ph的確定根據(jù)前面的研究，將菌株以4%接種量接種到培養(yǎng)基中，裝液量為90mL/250mL，初始pH為5.5，在溫度為34℃、180r/min條件下培養(yǎng)3d，檢測酶活。結(jié)果表明，優(yōu)化后酶活為28.27U/L，比優(yōu)化前提高了20.92%。2.2酶特征的研究2.2.1溫度對阿魏酸酯酶穩(wěn)定性的影響阿魏酸酯酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性，最適pH值及pH穩(wěn)定性分別見圖5和圖6。由圖5A可知，當(dāng)溫度<50℃時，酶活呈逐漸上升狀態(tài)，這是因為在此溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，促進(jìn)了反應(yīng)速度；當(dāng)溫度為50℃，此時相對酶活最高為100%；當(dāng)溫度>50℃時，隨著溫度的升高，酶活呈下降狀態(tài)，這是因為過高的溫度會導(dǎo)致酶蛋白開始變形。因此，酶的最適溫度為50℃。由圖5B可知，阿魏酸酯酶在30～40℃范圍內(nèi)時穩(wěn)定性很好，在溫度為50℃時表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性，50℃保溫50min后，酶活仍保留58.96%。但當(dāng)溫度為60℃時，阿魏酸酯酶穩(wěn)定性較差，保溫50min后殘余酶活不到20%。2.2.2酶最適ph的確定由圖6A可知，pH值為5.6時相對酶活最高為100%，兩邊呈遞減狀態(tài)，這是因為pH會改變底物分子和酶分子的帶電狀態(tài)，進(jìn)而影響酶和底物的結(jié)合，而且過高或過低的pH都會影響酶的穩(wěn)定性，從而使酶遭受不可逆的破壞。因此，酶的最適pH值為5.6。由圖6B可知，酶活在pH值為5.0～6.8范圍內(nèi)放置2h，其酶活穩(wěn)定性較好，殘余酶活均在80%以上，pH值在3.2～3.8范圍內(nèi)，酶活穩(wěn)定性較差。2.3蘑菇kosakoda2初步應(yīng)用2.3.1發(fā)酵過程中阿魏酸含量的變化由圖7可知，麩皮發(fā)酵提取液在1～7d，麩皮發(fā)酵釋放阿魏酸的含量呈現(xiàn)上升趨勢?？瞻捉M的麩皮阿魏酸含量為13.374μg/g，麩皮發(fā)酵至第7天時的阿魏酸含量為16.3715μg/g，比空白組的麩皮阿魏酸含量提高了22.42%，該菌株發(fā)酵麩皮產(chǎn)生的阿魏酸酯酶，能夠釋放麩皮中的阿魏酸，從而提高釋放的阿魏酸含量，說明菌株發(fā)酵能夠提高麩皮中阿魏酸的釋放。2.3.2酵母粉發(fā)酵過程中阿魏酸酯酶的釋放由圖8可知，第0天的糟醅發(fā)酵提取液中阿魏酸的含量為11.1366μg/g，接菌的糟醅發(fā)酵第一天的阿魏酸含量與發(fā)酵0d的糟醅發(fā)酵提取液中的阿魏酸含量相比有所增加，第二天之后呈現(xiàn)下降趨勢，可能是因為前期三角瓶中含有氧氣，菌株能夠生長，產(chǎn)生的阿魏酸酯酶釋放了糟醅中的阿魏酸，沒有氧氣后，糟醅中的阿魏酸不再被釋放，又因為阿魏酸被分解，所以阿魏酸的含量逐漸減少。對照組中糟醅的阿魏酸被分解，含量逐漸減少，沒有上升的過程。說明菌株在前期有氧條件下能起到釋放阿魏酸的作用的；氧氣消耗完后，菌株停止產(chǎn)酶，阿魏酸含量逐漸降低。2.3.3阿魏酸酯酶檢測由圖9可知，第0天的大曲發(fā)酵提取液中阿魏酸的含量為4.0548μg/g，實驗組中的阿魏酸含量呈現(xiàn)遞增的趨勢。這是因為實驗組中接種的菌株產(chǎn)生阿魏酸酯酶，釋放了大曲中的阿魏酸，所以阿魏酸含量呈遞增趨勢。對照組中阿魏酸含量呈現(xiàn)先遞減后遞增的趨勢，出現(xiàn)遞增的趨勢可能是因為大曲中本身含有可以產(chǎn)阿魏酸酯酶的菌株，使大曲中的阿魏酸被釋放出來，所以出現(xiàn)遞增的趨勢。出現(xiàn)遞減的趨勢可能是因為前期阿魏酸的分解速度大于阿魏酸酯酶釋放阿魏酸的速度，所以出現(xiàn)遞減的趨勢。但是對照組與實驗組相比，對照組中的阿魏酸被釋放的含量較少，說明添加菌株有利于釋放大曲中阿魏酸，且能夠增加釋放阿魏酸的速度。3反應(yīng)溫度