骨素中膠原含量測定方法的研究

中國擁有豐富的動物骨骼資源，每年產(chǎn)生1200萬噸t動物骨骼。畜禽骨中含有大量的骨膠蛋白、礦物質(zhì)、粘多糖、生長素等營養(yǎng)物質(zhì)[1~2],但是長期由于技術(shù)水平的限制被浪費掉或經(jīng)過簡單加工成附加值很低的產(chǎn)品。近年來,畜禽骨經(jīng)抽提、濃縮、調(diào)和制備成骨素實現(xiàn)了畜禽骨的精深加工和高值化利用,骨素因其“天然、綠色、健康”的特性,廣受消費者好評。骨素中膠原蛋白含量是骨素品質(zhì)的主要評定指標(biāo),但是目前骨素生產(chǎn)企業(yè)沒有一套完善可行的膠原蛋白含量測定方法,僅僅用粗蛋白含量來表征膠原蛋白含量,可能會出現(xiàn)摻假行為,加大了骨素質(zhì)量安全控制的難度,所以目前急需一種簡單、方便、準(zhǔn)確、成本低、周期短的方法來測定骨素中膠原蛋白含量。目前文獻(xiàn)報道中膠原蛋白含量的測定主要是離子色譜法、高效液相色譜法、毛細(xì)血管電泳法和分光光度法[6~7]等。由于分光光度法成本低,操作簡單在測定膠原蛋白時用得較多,分光光度法測定膠原蛋白主要通過測定膠原蛋白中羥脯氨酸含量再乘以膠原蛋白換算系數(shù)而得到,由于羥脯氨酸(HYP)是膠原蛋白的特異性氨基酸,含量穩(wěn)定(占總氨基酸的12~14%)。但是膠原蛋白換算系數(shù)在不同物種、部位存在差異,目前沒有一個規(guī)范的數(shù)值,對膠原蛋白換算系數(shù)引用混亂。Etherington對陸生動物膠原蛋白換算系數(shù)常用7.1,水生動物多采用11.1,但Kittiphattanabawon在研究大眼鯛魚皮時用7.7作為換算系數(shù),Neuman用7.46作為哺乳動物和鳥類的換算系數(shù),施輝陽在研究豬皮膠原蛋白測定時用10.0作為換算系數(shù),王信蘇測定出草魚魚鱗膠原蛋白換算系數(shù)為14.9,關(guān)于畜禽骨膠原蛋白換算系數(shù)也沒有相關(guān)的研究報道。本文通過提取骨素生產(chǎn)中常用畜禽骨膠原蛋白,測定不同原料骨膠原蛋白換算系數(shù),系統(tǒng)的研究了骨素中膠原蛋白含量的測定方法,為骨素生產(chǎn)企業(yè)提供切實可行、操作簡單、成本低、周期短的骨素中骨膠原蛋白含量測定方法。1材料和方法1.1實驗儀器和材料T6紫外分光光度計,北京普希通用儀器有限公司;LDZX-50KBS立式蒸汽滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠;BCD-2182M2D美菱冰箱,合肥美菱股份有限公司;PG-150破骨機,廊坊市頂天輕工機械有限公司;Neofuge-15R高速冷凍離心機,上海力申科學(xué)儀器有限公司;DH6-90385-Ⅲ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;PG-150破骨機,廊坊市頂天輕工機械有限公司。豬腿骨、牛腿骨、羊腿骨、雞骨均購于北京超市發(fā)超市;豬骨素、牛骨素、雞骨素購于河南大用普樂泰生物科技有限公司;羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、對二氨基苯甲醛、無水乙酸鈉、氯胺T、丁醇、乙酸等(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制緩沖溶液、顯色劑、氯胺T、標(biāo)準(zhǔn)儲備液等溶液配制參照GB/T9695.23-2008的方法。準(zhǔn)確移取5.00mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液至500mL容量瓶中,蒸餾水定容后分別吸取該溶液10mL、20mL、30mL、40mL、50mL于100mL容量瓶中,用水定容分別得到濃度為0.5μg/mL、1.0μg/mL、1.5μg/mL、2.0μg/mL、2.5μg/mL的HYP標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取4mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于比色管中,同時用蒸餾水代替HYP溶液做空白,加入2mL氯胺T,混合于室溫下放置20min,再加入2mL顯色劑于比色管中,充分混合封口后放入60℃水浴中加熱20min,取出比色管,用流動水冷卻比色管至少3min,在室溫下放置30min,用水作參比于558nm處用紫外分光光度計測定吸光值。以得到標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光值扣除空白的吸光值為縱坐標(biāo),以相應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.3edta溶液的制備用破骨機將豬腿骨、牛腿骨、羊腿骨、雞骨充分破碎后取100g用蒸餾水沖洗干凈除去雜質(zhì)和血水后分別裝入2L燒杯中。分別加入1L,10%正丁醇溶液于4℃浸泡2d以除去脂肪,每天換一次丁醇溶液。過濾后骨渣用蒸餾水反復(fù)沖洗,充分瀝干后用1L,0.1mol/LNaOH溶液于4℃浸泡1d,每2h攪拌一次以除去非膠原蛋白及防止內(nèi)源性蛋白酶對膠原蛋白的影響。過濾、洗凈、瀝干后加入1L,0.5mol/LEDTA溶液(pH7.4)4℃浸泡5d,每天換一次EDTA溶液以起脫鈣的作用。過濾、洗凈、瀝干提取膠原蛋白,膠原蛋白提取分別用熱提取和酸提取。熱提取:取50g骨渣加入100mL蒸餾水于高壓滅菌鍋中100℃提取1.5h得到骨膠原蛋白原液。酸提取參照Nagai的方法:50g骨渣加入100mL、0.5mol/L的乙酸溶液并于4℃下浸泡3d,經(jīng)4℃,20,000×g離心30min后上清液即為粗膠原蛋白。1.4測定了羥基和hyp的含量1.4.1測定了紙漿含量骨膠原蛋白原液和粗膠原蛋白中膠原蛋白含量用凱氏定氮法測定,蛋白換算系數(shù)為6.25。1.4.2hyp含量測定準(zhǔn)確稱取2g左右的各種骨膠原蛋白原液和粗膠原蛋白于厭氧管中,加入20mL,3mol/L硫酸并于105℃干燥箱中恒溫16h,消化完后水解產(chǎn)物過濾至100mL的容量瓶,厭氧管用5mL,3mol/L硫酸沖洗并一起定容,移取體積V(5mL~15mL)的水解產(chǎn)物于100mL量瓶中定容。取4mL定容后的溶液代替標(biāo)準(zhǔn)HYP溶液按照1.2中步驟處理后在波長558nm處測定吸光值(A558),用相應(yīng)的吸光值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得對應(yīng)的HYP含量。試樣中HYP含量按下式計算:注:X-樣品中HYP含量(%);c-標(biāo)準(zhǔn)曲線上相對應(yīng)的HYP的含量(μg/mL);m-樣品的質(zhì)量(g),V-移取的水解產(chǎn)物體積。1.5計算出的勞工換算系數(shù)1.6hyp含量測定取骨素(豬骨素、牛骨素和雞骨素),按照GB/T9695.23-2008/ISO3496:1994的方法測定HYP含量。用骨素中HYP含量乘以對應(yīng)的膠原蛋白換算系數(shù)得到骨素中膠原蛋白含量。1.7穩(wěn)定和回收率的測定1.7.1相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)的測定,hyp的測定是一個相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,2稱取一定量的骨素(豬骨素、牛骨素、雞骨素),按照1.4.2的方法平行測定4次HYP的含量,計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)和變異系數(shù)(CV)。1.7.2加回收率測定hyp量稱取2g樣品(豬骨素、牛骨素、雞骨素),分別加入標(biāo)準(zhǔn)HYP,按1.4.2方法測定HYP含量,按下式計算回收率:注:A-加入HYP后樣品中測定出HYP量(mg);B-樣品中HYP測定量;C-加入標(biāo)準(zhǔn)HYP量。1.8數(shù)據(jù)計數(shù)采用SAS8.2軟件中的一般線性模型中的最小乘法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析(p<0.05)。2結(jié)果與討論2.1橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線按1.2的方法,根據(jù)測定的吸光值扣除空白的吸光值為縱坐標(biāo),以相應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。并計算出回歸方程為Y=0.219+0.002,HYP濃度(X)與吸光度(Y)之間的線性相關(guān)系數(shù)r=0.9995(P<0.001),顯示出HYP濃度與吸光度之間有良好的線性關(guān)系。2.2骨素中膠原蛋白的多因子及其第二性不同提取方式的膠原蛋白換算系數(shù)見表1,熱提取和酸提取膠原蛋白換算系數(shù)基本一致,說明水溶性膠原蛋白和酸溶性膠原蛋白中羥脯氨酸含量基本一致。由于骨素中的膠原蛋白是水溶性膠原蛋白,在測定骨素中骨膠原蛋白含量時應(yīng)選用熱提取時的膠原蛋白換算系數(shù)。不同骨之間膠原蛋白換算系數(shù)有一定差異,其中牛骨換算系數(shù)值相對較大,豬骨膠原蛋白換算系數(shù)最小。在測定不同骨的骨素時引用相對應(yīng)膠原蛋白換算系數(shù)即可。2.3雞骨蛋白的膠原蛋白不同骨素之間膠原蛋白含量有一定差異(表2),其中雞骨素膠原蛋白含量最高,原因可能是雞骨中軟骨較多,雞骨蛋白中含有20%左右的膠原蛋白。不同批次的骨素,總固形物含量不同,也會導(dǎo)致不同骨素之間的膠原蛋白含量有一定的差異。2.4hyp穩(wěn)定性不同骨素中HYP含量經(jīng)過4次平行測定結(jié)果如表3所示。該方法測定豬、牛、雞骨素樣品中HYP含量的標(biāo)準(zhǔn)差分別為0.01%、0.01%、0.03%,變異系數(shù)分別為0.44%、1.07%、2.26%,說明該方法對測定骨素中HYP含量具有非常好的穩(wěn)定性。由表4可以看出,豬、牛、雞骨素的回收率分別在98.48~103.29%、99.84~100.22%、97.48~100.35%之間,平均回收率分別為100.44%、99.98%、99.36%。RSD均小于2.2%,綜合穩(wěn)定性和