小柴胡湯對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠的抗肝纖維化作用

小柴胡湯是緩解少陽(yáng)的代表方劑，臨床應(yīng)用廣泛。以活血化瘀,舒肝活絡(luò)為基本治法的復(fù)合中藥制劑在治療慢性肝炎和肝硬化患者,具有較好的降酶、退黃及抗纖維化作用。本研究將此制劑治療大鼠實(shí)驗(yàn)性肝纖維化,驗(yàn)證小柴胡湯的抗炎、抗纖維化作用,旨在為臨床治療肝病提供依據(jù)。1材料和方法1.1balibactorenis、生姜小柴胡湯出自張仲景《傷寒論》,由柴胡15g、黃芩9g、半夏9g、生姜9g、炙甘草9g、大棗12g、人參9g組成。柴胡bupleurumchinense河南產(chǎn);黃芩Scutellariabaicalensis陜西產(chǎn);半夏Pinelliaternata湖北產(chǎn);生姜Zingiberofficinalerosc河南產(chǎn);炙甘草GlycyrrhizauralensisFisch內(nèi)蒙古產(chǎn);大棗Chinesedate山東產(chǎn);人參Panaxginseng吉林產(chǎn)。中藥飲片購(gòu)自湖北弘康藥業(yè)有限公司,由十堰市人民醫(yī)院藥劑科監(jiān)制生產(chǎn),高劑量含生藥3.58g/kg,中劑量劑含生藥1.79g克/kg,低劑量劑含生藥0.358g/kg。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及動(dòng)物SD大鼠65只,雄雌各半,體重(180±20)g,清潔級(jí)大鼠,購(gòu)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,合格證號(hào)SCXK(鄂)2004-0007。1.3elisa試驗(yàn)40%(CCI4)用精制橄欖油配制。血清層粘連蛋白(Laminin,LN)、透明質(zhì)酸(Hyaluronicacid,HA)、Ⅲ型前膠原(procollagentypeⅢ,PCIII)及IV型膠原(CⅣ)放射免疫試劑盒購(gòu)于上海海軍醫(yī)學(xué)研究所;白細(xì)胞介素-2(IL-2)與白細(xì)胞介素-6(IL-6)ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司提供;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGFβ1)試劑盒由上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司提供。1.4儀器酶標(biāo)儀(型號(hào):Bs97-680)購(gòu)自美國(guó),AU5400全自動(dòng)生化測(cè)定儀,752型紫外分光光度計(jì)(型號(hào):UV-2550島津)產(chǎn)于日本1.5模型組和藥物治療組大鼠皮下注射20%ccl4油將大鼠隨機(jī)分成5組,每組13只,分正常對(duì)照組、肝纖維化模型組及藥物治療組(高、中、低劑量組)。造模方法參照文獻(xiàn)并加改進(jìn),具體如下:模型組和藥物治療組大鼠皮下注射40%CCl4油(CCl4與橄欖油混合物)2.5ml/kg(首次劑量加倍),每3d1次,共8周,對(duì)照組注射等劑量的精制橄欖油。治療組自實(shí)驗(yàn)開始分別給予高、中、低劑量3.58克/kg、1.79克/kg、0.358克/kg的小柴胡湯灌胃,模型組和對(duì)照組灌等量的生理鹽水。用藥至CCl4造模結(jié)束(8周)。所有大鼠均以普通飼料飼養(yǎng),飲自來(lái)水。1.5.1肝胰腺功能及血清風(fēng)險(xiǎn)管理各組分別在實(shí)驗(yàn)后8周,用2%戊巴比妥45mg/kg體重腹腔注射麻醉后心臟取血,分離血清,-20C保存。用AU5400全自動(dòng)生化測(cè)定儀分別測(cè)定肝功能,即谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(-GT)、血清總膽紅素(TBIL)、清蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)等;血清LN、HA、PCIII及IV型膠原以放射免疫法測(cè)定;大鼠IL-2與IL-6及TGFβ1采用ELISA法測(cè)定(均按試劑說(shuō)明書進(jìn)行)。1.5.2肝組織病理學(xué)檢測(cè)于第8周末處死大鼠,取肝右葉小塊組10%甲醛液固定,石蠟包埋,4m厚連續(xù)切片并進(jìn)行HE及膠原Masson染色,光鏡下觀察肝組織細(xì)胞的病理改變及肝臟纖維的增生程度,制定膠原纖維增生程度半定量標(biāo)準(zhǔn)。1.5.3肝骨折的分類標(biāo)準(zhǔn)2結(jié)果2.1兩組患者的健康狀態(tài)模型組動(dòng)物精神差,倦臥少動(dòng),皮毛松弛,眼、唇、耳、尾部黯淡,食欲差,消瘦,體重明顯下降。治療組健康狀態(tài)相對(duì)較好,皮毛柔順有光澤。正常大鼠行為敏捷,食欲正常,皮毛濃密有光澤,體重自然增加。2.1.1對(duì)基本蛋白表達(dá)的影響肝纖維化模型組與對(duì)照組、高劑量組及中劑量組比較;轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素及谷氨酰轉(zhuǎn)移酶等P<0.01,有顯著差異,但低劑量組無(wú)差異。白蛋白及球蛋白模型組與對(duì)照組比較;P<0.01,有顯著差異,與高劑量組比較ALBP<0.05,GLBP<0.01,均有顯著差異,中、低劑量組無(wú)顯著差異(P>0.05),見表1。2.2.2兩組血清層粘連蛋白比較透明質(zhì)酸、Ⅲ型前膠原及Ⅳ型膠原等,均有顯著差異。血清層粘連蛋白與對(duì)照組比較,有顯著差異。與高、中劑量比較P<0.05,有顯著差異,見表2。2.2.3il-6檢測(cè)方法模型組大鼠IL-2低于對(duì)照組,小柴胡湯高劑量組、中劑量組;IL-6高于對(duì)照組及小柴胡湯高劑量組、中劑量組(P<0.05)。TGFβ1模型組高于對(duì)照組、高劑量組,見表3。2.2.3中有炎性細(xì)胞浸漬肝組織病理學(xué)變化蘇木精-伊紅染色標(biāo)本觀察:正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整,肝細(xì)胞排列整齊,無(wú)變性壞死。模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞,肝細(xì)胞廣泛脂肪變性,大部分標(biāo)本可見程度、范圍不等的肝細(xì)胞壞死,肝組織中有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。高劑量組肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常,肝小葉周邊肝細(xì)胞有輕度脂肪變性,匯管區(qū)偶見少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。中劑量組肝細(xì)胞脂肪變性,匯管區(qū)及肝小葉內(nèi)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn),低劑量組可見有肝細(xì)胞變性壞死。Masson染色標(biāo)本觀察:模型組肝組織內(nèi)有大量纖維組織增生形成纖維間隔,膠原纖維從匯管區(qū)向小葉內(nèi)延伸,其破壞界板,分割、包繞肝小葉,部分標(biāo)本內(nèi)可見完整的假小葉。中劑量組肝組織內(nèi)膠原纖維增生明顯減輕,無(wú)假小葉形成。高劑量組部分標(biāo)本有輕度纖維組織增生,主要散在于中央靜脈和匯管區(qū)。低劑量組可見匯管區(qū)有纖維組織增生,呈寬帶狀,伸展包繞或分割肝小葉,中央靜脈有偏位現(xiàn)象。各組大鼠肝纖維化程度分期見表4。3肝纖維化的干預(yù)作用中醫(yī)學(xué)認(rèn)為肝纖維化的本質(zhì)之一是肝血瘀阻,經(jīng)隧阻塞,血不養(yǎng)肝。故肝纖維化的傳統(tǒng)治法是活血化瘀、軟堅(jiān)消癥。小柴胡湯首見于中國(guó)漢代仲師《傷寒論》中少陽(yáng)病之主方,但因其病機(jī)復(fù)雜,治療范圍廣泛,臨床如何更廣泛更準(zhǔn)確的應(yīng)用小柴胡湯及其類方是難題。研究表明,小柴胡湯的體外研究發(fā)現(xiàn)能增加白介素-2、白介素6,干擾素、腫瘤壞死因子和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的生成。目前小柴胡湯仍然廣泛用于慢性乙型肝炎的治療并取得較好療效。本研究采用經(jīng)典的肝纖維化動(dòng)物模型,用小柴胡湯抗肝纖維化治療。通過(guò)對(duì)血清中的HA、PCⅢ、Ⅳ-C、LN是判定肝纖維化的有效指標(biāo)測(cè)定,小柴胡湯可顯著降低肝纖維化指標(biāo),治療的患者肝臟炎癥活動(dòng)度和纖維化程度均有較明顯的改善,表明其有較好減輕甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化。結(jié)果顯示小柴胡湯對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷,同樣有較好的降酶、退黃作用,能使實(shí)驗(yàn)鼠的血清纖維化指標(biāo)顯著降低。HEG染色也顯示治療組肝細(xì)胞壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維結(jié)締組織增生均較模型組明顯減輕,說(shuō)明小柴胡湯有較好的護(hù)肝和抗肝纖維化作用?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,肝星形細(xì)胞(HSC)活化、增殖、細(xì)胞數(shù)量增加,而使細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的合成增加是肝纖維化形成的直接原因,本研究對(duì)淋巴因子IL-2、IL-6及TGFβ1進(jìn)行了檢測(cè),IL-2對(duì)T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞都有明顯的刺激作用,使細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)、天然殺傷細(xì)胞(NK)、淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK)和腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(TIL)增殖,并使其殺傷活性增強(qiáng),進(jìn)而清除體內(nèi)腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞等,具有抗病毒、抗腫瘤和提高機(jī)體免疫功能等作用。而正常情況下,IL-6在體內(nèi)合成較少,當(dāng)發(fā)生肝損傷時(shí),局部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),TNF-a可誘導(dǎo)IL-6生成,加重肝細(xì)胞壞死,對(duì)機(jī)體的免疫功能具有調(diào)節(jié)作用。本研究表明小柴胡湯能升高LL-2水平,降低IL-6水平,減輕肝損傷。TGFβ1自20世紀(jì)70年代末從血小板中分離出來(lái),通過(guò)與其受體蛋白結(jié)合,以及胞內(nèi)信號(hào)傳遞,誘導(dǎo)HSC的活化,抑制HSC的凋亡,致ECM在肝組織內(nèi)異常大量的沉積,是目前已知致肝纖維化最重要的細(xì)胞因子之一綜上所述,小柴胡湯對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化有良好的干預(yù)作用,值得深入研究。蘇木精-伊紅染色和Masson染