藥物遺傳毒性和致癌性研究現(xiàn)狀和動(dòng)向2023/9/81常艷國(guó)家上海新藥安全評(píng)價(jià)研究中心藥物遺傳毒性和致癌性研究現(xiàn)狀和動(dòng)向2023/8/31常艷1藥物遺傳毒性評(píng)價(jià)的指導(dǎo)原則1遺傳毒性試驗(yàn)方法的研究2藥物致癌性評(píng)價(jià)的概要3傳統(tǒng)和替代致癌試驗(yàn)的研究434主要內(nèi)容藥物遺傳毒性評(píng)價(jià)的指導(dǎo)原則1遺傳毒性試驗(yàn)方法的研究2藥物致癌2

遺傳毒性評(píng)價(jià)的指導(dǎo)原則

SFDA-中國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局

ICH-人用藥物注冊(cè)技術(shù)規(guī)定國(guó)際協(xié)調(diào)組織

OECD-經(jīng)濟(jì)合作發(fā)展組織

EMEA-歐洲藥品評(píng)價(jià)局

USFDA-美國(guó)藥監(jiān)局

USEPA-美國(guó)環(huán)境保護(hù)署

MHLW-日本厚生勞動(dòng)省其他世界性的政府法規(guī)部門(mén)

藥物研發(fā)監(jiān)管的主要藥政實(shí)體

遺傳毒性評(píng)價(jià)的指導(dǎo)原則

藥物研發(fā)監(jiān)管的主要藥政實(shí)體3OECD、EPA可供參考的遺傳毒性指導(dǎo)原則

遺傳毒性試驗(yàn)的指導(dǎo)原則

OECD、EPA可供參考的遺傳毒性指導(dǎo)原則

遺傳毒性試驗(yàn)的指4SFDA

體外：2項(xiàng)試驗(yàn)

?細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)（Ames）——Required

?染色體畸變?cè)囼?yàn)（CA）

OR

?小鼠淋巴瘤細(xì)胞tk基因突變?cè)囼?yàn)（MLA）

體內(nèi)：1項(xiàng)試驗(yàn)

?微核試驗(yàn)（MN）——Required

《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》ZHGPT2-1,2007等同于ICHS2BSFDA《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》ZHGPT2-5ICH

S2A+S2BICHS2A+S2B6FDA-RedbookRedbook2000:IV.C.1Short-TermTestsforGeneticToxicityJuly2007Redbook2000:IV.C.1.aBacterialReverseMutationTest

Redbook2000:IV.C.1.bInvitroMammalianChromosomalAberrationTestRedbook2000:IV.C.1.cMouseLymphomaThymidineKinaseGeneMutationAssayRedbook2000:IV.C.1.dMammalianErythrocyteMicronucleusTestFDA-RedbookRedbook2000:IV.C.7FDA-CDERFDA-CDER8FDA-CDERFDA-CDER9EMEAEMEA10EMEAEMEA11EMEAEMEA12Step2Step1Step3Step42006200720082009~2011

2006.06ICHSC同意啟動(dòng)修訂工作

2006.10ICHEWG討論籌劃修訂方法

2007.05對(duì)修訂內(nèi)容達(dá)成一致意見(jiàn)，開(kāi)始起草S2(R1)

2007.10完成起草的S2(R1)

2008.02簽署S2(R1)，完成step2

2008.06審議意見(jiàn)，回答公共注釋

2008.11未按期開(kāi)會(huì)（未獲得彗星試驗(yàn)數(shù)據(jù)）

2009.06

體內(nèi)試驗(yàn)單次和重復(fù)給藥方案都接受

FDA對(duì)取消體外細(xì)胞試驗(yàn)或降低最高濃度和細(xì)胞毒性提出異議

2011.11S2(R1)正式頒布遺傳毒性標(biāo)準(zhǔn)組合試驗(yàn)的修訂2009~2011Step2Step1Step3Step420062013ICHS2A+S2B=S2(R1)S2R1的修訂宗旨：減少體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞試驗(yàn)的假陽(yáng)性動(dòng)物試驗(yàn)3R原則（替代、減少和優(yōu)化）Invivo：

建議整合入重復(fù)給藥毒性實(shí)驗(yàn)中每次實(shí)驗(yàn)不必使用平行的陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)ICHS2A+S2B=S2(R1)S2R1的修訂宗旨：I14ICHS2A+S2B=S2(R1)ICHS2A+S2B=S2(R1)15遺傳毒性標(biāo)準(zhǔn)組合試驗(yàn)的修訂S2BS2R1選擇一選擇二細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)（withrepeat）細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)（Norepeat）細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)（Norepeat）體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞試驗(yàn)：CA/MLA10mMCellgrowth:50%/RTG:

80%體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞試驗(yàn)：CA/MLA/MN

1mM

≤50%/

≥80%無(wú)體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞試驗(yàn)體內(nèi)微核試驗(yàn)（單獨(dú)一項(xiàng)且是急性毒性試驗(yàn)）體內(nèi)微核試驗(yàn)（整合至一般毒理試驗(yàn)中）一項(xiàng)體內(nèi)微核試驗(yàn)+一項(xiàng)體內(nèi)不同檢測(cè)終點(diǎn)/組織試驗(yàn)（肝Comet試驗(yàn)）（整合至一般毒理試驗(yàn)中或聯(lián)合在同一個(gè)試驗(yàn)）遺傳毒性標(biāo)準(zhǔn)組合試驗(yàn)的修訂S2BS2R1選擇一選擇二細(xì)菌回復(fù)16整合試驗(yàn)的最高劑量和暴露整合試驗(yàn)的最高劑量和暴露17ICHS2(R1)修訂小結(jié)

S2A和S2B整合入一個(gè)指導(dǎo)原則中；

提供可選擇的遺傳毒性試驗(yàn)組合；減少體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞試驗(yàn)不相關(guān)的陽(yáng)性；

體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)可以整合入重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)中；

無(wú)需每一項(xiàng)體內(nèi)試驗(yàn)都設(shè)同步的陽(yáng)性對(duì)照；體外細(xì)菌突變?cè)囼?yàn)無(wú)需重復(fù)試驗(yàn)。ICHS2(R1)修訂小結(jié)S2A和S2B整合入一個(gè)指導(dǎo)原18ICHS2(R1)

PfuhlerS.etal.2009ICHS2(R1)PfuhlerS.etal.219藥物遺傳毒性評(píng)價(jià)的指導(dǎo)原則1遺傳毒性試驗(yàn)方法的研究2藥物致癌性評(píng)價(jià)的概要3傳統(tǒng)和替代致癌試驗(yàn)的研究434主要內(nèi)容藥物遺傳毒性評(píng)價(jià)的指導(dǎo)原則1遺傳毒性試驗(yàn)方法的研究2藥物致癌20遺傳毒性傳統(tǒng)試驗(yàn)方法31細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)（Ames試驗(yàn)）人工誘變的突變株在組/色氨酸操縱子中有一個(gè)突變，突變的菌株必須依賴外源性組/色氨酸才能生長(zhǎng)，而在無(wú)組/色氨酸的選擇性培養(yǎng)基上不能存活，致突變物可使其基因發(fā)生回復(fù)突變，使它在缺乏組/色氨酸的培養(yǎng)基上也能生長(zhǎng)。野生型（原養(yǎng)型）突變型（缺陷型）遺傳毒性傳統(tǒng)試驗(yàn)方法31細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)（Ames試驗(yàn)）人工21Ames試驗(yàn)測(cè)試系統(tǒng)：細(xì)菌鼠傷寒沙門(mén)氏菌：組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型埃希氏大腸桿菌：色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株特性鑒定Ames試驗(yàn)測(cè)試系統(tǒng)：細(xì)菌22菌株組/色氨酸突變?nèi)笔Э蓹z測(cè)的突變類型修復(fù)LPSVIT質(zhì)粒TA1535G46urvB-rfa-

bio----堿基置換TA1537C3076urvB-rfa-bio----移碼TA97D6610urvB-rfa-bio-pKM101移碼TA98D3052urvB-rfa-bio-pKM101移碼TA100G46urvB-rfa-bio-pKM101堿基置換TA102G428urvB+rfa-bio-pKM101堿基置換WP2uvrAtrypEuvrA---pKM101堿基置換Ames試驗(yàn)菌株組/色氨酸突變?nèi)笔Э蓹z測(cè)的修復(fù)LPSVIT質(zhì)粒TA1523Ames試驗(yàn)Ames試驗(yàn)24濃度設(shè)置陰性對(duì)照組/溶劑對(duì)照組；受試物至少五個(gè)劑量組；陽(yáng)性對(duì)照組；Ames試驗(yàn)濃度設(shè)置陰性對(duì)照組/溶劑對(duì)照組；Ames試驗(yàn)25方法平板摻入法：-0.1mL受試菌液；-0.1mL受試物、溶劑對(duì)照或陽(yáng)性物溶液；-0.5mL磷酸鈉緩沖液/S9混合液；-2.0mL融溶的頂層瓊脂（0.6％瓊脂、0.5％NaCl、0.5mM生物素

和0.05mML－組胺酸）

混合后，鋪于底層瓊脂上，室溫凝固。Ames試驗(yàn)方法平板摻入法：Ames試驗(yàn)26預(yù)培養(yǎng)法-將下列物質(zhì)在冰浴上混合：

0.5mLS9混合液或0.5mL磷酸緩沖液

0.1mL過(guò)夜培養(yǎng)菌液（大約10^8菌量）

0.01mL受試物溶液（或?qū)φ?，溶劑和?yáng)性對(duì)照物溶液）

-將該混合液在37℃下培養(yǎng)20分鐘（水浴中）-然后加入2mL含有0.6％瓊脂、0.5％NaCl、0.5mM生物素和0.05mML－

組胺酸的融溶頂層培養(yǎng)基，鋪至基礎(chǔ)培養(yǎng)瓊脂表面（V-B培養(yǎng)基E），在

室溫下凝固。

Ames試驗(yàn)預(yù)培養(yǎng)法Ames試驗(yàn)27代謝活化系統(tǒng)大鼠肝S9混合液S9制備方法：取5只雄性大鼠，處死大鼠的前5天單次腹腔注射給予500mg/kg的Aroclor1254。處死，放血，無(wú)菌取肝組織，勻漿，經(jīng)9000g離心10分鐘后的上清液部分為S9。將S9分裝成2-4mL/管，冷凍保存在-70℃～-85℃。

Ames試驗(yàn)代謝活化系統(tǒng)大鼠肝S9混合液Ames試驗(yàn)28結(jié)果觀察和判定計(jì)數(shù)突變菌落數(shù)－致突變性觀察背景菌斑－毒性判斷是否具有致突變性Ames試驗(yàn)結(jié)果觀察和判定計(jì)數(shù)突變菌落數(shù)－致突變性Ames試驗(yàn)29假設(shè)的證明無(wú)組氨酸的VB平皿7個(gè)克隆來(lái)自0對(duì)照平皿

劃線7個(gè)克隆來(lái)自1000ug/皿處理組劃線全部生長(zhǎng):克隆為組氨酸回復(fù)突變克隆無(wú)生長(zhǎng)：克隆不是組氨酸回復(fù)突變克隆Ames試驗(yàn)—案例1假設(shè)的證明無(wú)組氨酸的VB平皿7個(gè)克隆來(lái)自0對(duì)照平皿7個(gè)克隆來(lái)30測(cè)試系統(tǒng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞：CHL,CHO

人外周血淋巴細(xì)胞細(xì)胞核型遺傳毒性試驗(yàn)的技術(shù)要點(diǎn)32染色體畸變?cè)囼?yàn)(CA)測(cè)試系統(tǒng)遺傳毒性試驗(yàn)的技術(shù)要點(diǎn)32染色體畸變?cè)囼?yàn)(CA)31劑量設(shè)置陰性對(duì)照組/溶劑對(duì)照組；受試物至少三個(gè)劑量組；陽(yáng)性對(duì)照組；染色體畸變?cè)囼?yàn)劑量設(shè)置陰性對(duì)照組/溶劑對(duì)照組；染色體畸變?cè)囼?yàn)32方法細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)；受試物處理；加入秋水仙素，使細(xì)胞停止于分裂中期；收獲細(xì)胞，滴片空氣干燥，染色染色體畸變?cè)囼?yàn)方法細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)；染色體畸變?cè)囼?yàn)33包括代謝活化和非代謝活化條件在處理后6和24小時(shí)收獲細(xì)胞代謝活化條件下，受試物處理時(shí)間為3小時(shí)染色體畸變?cè)囼?yàn)處理?xiàng)l件包括代謝活化和非代謝活化條件染色體畸變?cè)囼?yàn)處理?xiàng)l件34讀片分析有絲分裂指數(shù)－毒性染色體結(jié)構(gòu)畸變?nèi)旧w數(shù)目畸變?nèi)旧w畸變?cè)囼?yàn)讀片分析有絲分裂指數(shù)－毒性染色體畸變?cè)囼?yàn)35試驗(yàn)系統(tǒng)小鼠淋巴瘤L5178YTK+/-細(xì)胞既能夠檢測(cè)點(diǎn)突變，也能夠檢測(cè)出大的染色體損傷自發(fā)突變率高，需要定期清除自發(fā)突變。33小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)（MLA）遺傳毒性傳統(tǒng)試驗(yàn)方法試驗(yàn)系統(tǒng)33小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)（MLA）遺傳毒性傳統(tǒng)試驗(yàn)方法36ThymidineKinase(TK):233aminoacidsCodedbytheautosomaltkgenetkgene:Situatedatthedistalendoftheq-armofchromosome11(mouse)orchromosome17(human)Sizeoftkgene:11kbwith5intronstklocusmutation:tk+tk-allelecausedbyTGtransversionatposition489小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)（MLA）基本原理ThymidineKinase(TK):233am37Targetcell：MouselymphomaL5178Ytk

+/-3.7.2Ccellline(D.Clive&P.Voytek.MutatRes,1977)L5178Y-3cellline（tk

+/+）EMStreatmentL5178Y-3.7.2cellline（tk

+/-）L5178Y-3.7cellline（tk

-/-）Spontaneousreversemutation(selectedbyTHMGmedium)MLA基本原理Targetcell：MouselymphomaL5138TK+/-cells(TFTsensitive&THMGresistant)TK-/-cells(TFTresistant&THMGsensitive)Mutagentreatment

TK+/-cells(L5178Y,TK6,WTK1)treatedbychemicals,andthenselectedbyTFT(trifluorothymidine)Thegrowingcolony—TFTresistant(TK-/-)mutantMLA基本原理TK+/-cells(TFTsensitive&39培養(yǎng)基不含馬血清的RPMI1640培養(yǎng)基含10%馬血清的RPMI1640培養(yǎng)基含20%馬血清的RPMI1640培養(yǎng)基小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)（MLA）培養(yǎng)基不含馬血清的RPMI1640培養(yǎng)基小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)（40受試物處理時(shí)間

TK基因突變?cè)囼?yàn)中，要使用短時(shí)處理(3～4小時(shí))方式。但張立實(shí)和Honma等的研究表明，使用長(zhǎng)時(shí)間(24或48小時(shí))處理可顯著提高M(jìn)LA對(duì)某些染色體斷裂劑和紡錘體毒物的檢出率。小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)（MLA）受試物處理時(shí)間TK基因突變?cè)囼?yàn)中，要使用短時(shí)處理(341突變選擇劑

在MLA中最初使用5-溴脫氧尿苷（BUdR）作為突變選擇劑，后來(lái)改用三氟胸苷（TFT）。二者均為胸苷類似物，都能被胸苷激酶磷酸化，其磷酸化產(chǎn)物摻入DNA可導(dǎo)致tk+/-細(xì)胞死亡。但TFT的作用比BUdR更迅速，TFT在一個(gè)細(xì)胞世代即可阻滯tk+/-細(xì)胞，因此TFT選擇平板背景清晰；而B(niǎo)UdR則需要經(jīng)歷數(shù)個(gè)細(xì)胞世代才能完全阻滯tk+/-細(xì)胞，故可產(chǎn)生分散的微小集落（microcolony），形成特征性的背景陰影（backgroundhaze）。因此，現(xiàn)TFT已基本取代了BUdR，成為T(mén)K基因突變?cè)囼?yàn)的常規(guī)選擇劑。小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)（MLA）突變選擇劑在MLA中最初使用5-溴脫氧尿苷（BUd42基本方法軟瓊脂平皿法（softagarmethod）在美國(guó)使用較多。在平皿中生長(zhǎng)的抗性突變細(xì)胞集落呈近似正態(tài)分布，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可計(jì)算克隆效率（cloningefficiency，CE）和突變率（mutationfrequency，MF）等指標(biāo)。微孔平板（microwellmethod）（即96孔培養(yǎng)板）法在歐洲使用較多。在微孔中生長(zhǎng)的抗性突變細(xì)胞集落呈Poisson分布，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可計(jì)算接種效率（platingefficiency，PE）和突變率等指標(biāo)。小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)（MLA）基本方法軟瓊脂平皿法（softagarmethod）在美43CellsExpression(2d)Chemicaltreatment(3hor24h)PlatingforPE0PlatingforPE2PlatingforTFTrIncubation(12d)ColonycountingandcalculationIncubation(12d)小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)（MLA）CellsExpression(2d)Chemicalt44突變集落在TK基因突變?cè)囼?yàn)中，經(jīng)過(guò)TFT選擇后長(zhǎng)出的抗性細(xì)胞集落（即tk-/-突變體）可分為兩種類型，即大集落（λ集落）和小集落（σ集落）。微孔平板法：大集落≥微孔直徑的1/4

小集落＜微孔直徑的1/4軟瓊脂平皿法：大集落直徑≥0.6mm

小集落直徑＜0.6mm大集落呈彌散性生長(zhǎng)，其密度低；小集落呈集中性生長(zhǎng)，其密度高。小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)（MLA）突變集落在TK基因突變?cè)囼?yàn)中，經(jīng)過(guò)TFT選擇后長(zhǎng)出的抗性細(xì)胞45

一般認(rèn)為大、小集落突變體是由于基因損傷的范圍和程度不同所致。大集落突變體的基因損傷多僅局限于

tk位點(diǎn)（即小范圍的點(diǎn)突變）；而小集落突變體是由較大范圍的染色體改變（染色體斷裂、缺失、重組或分離異常等）所致。這是TK基因突變?cè)囼?yàn)?zāi)軌驒z出基因突變和染色體畸變兩類終點(diǎn)，并能在一定程度上對(duì)二者加以區(qū)分的重要機(jī)理。但關(guān)于兩類集落產(chǎn)生的確切機(jī)制及其意義，還有待進(jìn)一步的研究。小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)（MLA）小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)（MLA）46小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)（MLA）試驗(yàn)結(jié)果的判定

各處理組的MF值呈濃度依賴性升高，判定為陽(yáng)性；MF值≥陰性對(duì)照值+126，判定為陽(yáng)性。（微孔法中的GEF=99+27=126）陽(yáng)性對(duì)照參考值其一，陽(yáng)性對(duì)照組總誘導(dǎo)率IMF至少≥300×10-6，其中小克隆IMF至少≥120×10-6其二，小克隆IMF至少≥150×10-6滿足上述標(biāo)準(zhǔn)之一，并且陽(yáng)性對(duì)照相對(duì)總生長(zhǎng)率（RTG）

≥10%結(jié)果評(píng)判小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)（MLA）試驗(yàn)結(jié)果的判定陽(yáng)性對(duì)照參考值結(jié)47原標(biāo)準(zhǔn)組合中唯一一項(xiàng)體內(nèi)試驗(yàn)采用大鼠或小鼠（6～10周）分析骨髓中嗜多染紅細(xì)胞中的微核，嗜多染紅細(xì)胞是紅細(xì)胞成熟的一個(gè)階段，主核已排出，容易觀察微核遺傳毒性試驗(yàn)的技術(shù)要點(diǎn)34體內(nèi)微核試驗(yàn)原標(biāo)準(zhǔn)組合中唯一一項(xiàng)體內(nèi)試驗(yàn)遺傳毒性試驗(yàn)的技術(shù)要點(diǎn)34體內(nèi)微48微核形成體內(nèi)微核試驗(yàn)微核形成體內(nèi)微核試驗(yàn)49劑量設(shè)置陰性對(duì)照組/溶劑對(duì)照組；受試物至少三個(gè)劑量組；陽(yáng)性對(duì)照組；（S2R1建議無(wú)需每次試驗(yàn)均設(shè)陽(yáng)性對(duì)照）體內(nèi)微核試驗(yàn)劑量設(shè)置陰性對(duì)照組/溶劑對(duì)照組；體內(nèi)微核試驗(yàn)50試驗(yàn)方法給藥－臨床擬用途徑；預(yù)試驗(yàn)中測(cè)定時(shí)相點(diǎn)，確定正式試驗(yàn)的采樣時(shí)間；收集骨髓細(xì)胞，離心，涂片，干燥，固定，染色體內(nèi)微核試驗(yàn)試驗(yàn)方法給藥－臨床擬用途徑；體內(nèi)微核試驗(yàn)51讀片計(jì)數(shù)PCE/NCE的比例－反映毒性計(jì)數(shù)含微核PCE的細(xì)胞百分率；體內(nèi)微核試驗(yàn)讀片計(jì)數(shù)PCE/NCE的比例－反映毒性體內(nèi)微核試驗(yàn)52S2R1推薦的試驗(yàn)方法測(cè)試系統(tǒng)

哺乳動(dòng)物細(xì)胞：CHL,CHO,V79胞質(zhì)分裂組織劑——松胞素B（Cyt-B）

通過(guò)阻止微絲聚合而破壞胞質(zhì)分裂所需的微絲環(huán)，從而達(dá)到阻滯胞漿分裂又不影響胞核分裂的目的。體外雙核微核S2R1推薦的試驗(yàn)方法測(cè)試系統(tǒng)體外雙核微核53濃度設(shè)置陰性對(duì)照組/溶劑對(duì)照組；受試物至少三個(gè)濃度組陽(yáng)性對(duì)照組；體外雙核微核試驗(yàn)濃度設(shè)置陰性對(duì)照組/溶劑對(duì)照組；體外雙核微核試驗(yàn)54方法細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)；受試物處理；收獲細(xì)胞，滴片空氣干燥，染色(+CytB)(+CytB)體外雙核微核試驗(yàn)方法細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)；(+CytB)(+CytB)體外雙核微核55讀片分析胞漿分裂阻斷增值指數(shù)（CBPI）－細(xì)胞毒性雙核微核率（1000～2000個(gè)雙核）體外雙核微核試驗(yàn)讀片分析胞漿分裂阻斷增值指數(shù)（CBPI）－細(xì)胞毒性體外雙核56給藥染毒采集血樣（～100l）－80℃至少固定3d離心(300g,10min,4℃)buffer洗脫孵育標(biāo)記FCM檢測(cè)4℃,30minRT/37℃,30minS2R1推薦的試驗(yàn)方法FCM體內(nèi)微核自動(dòng)化檢測(cè)給藥染毒采集血樣（～100l）－80℃至少固定3d離心(357FCM體內(nèi)微核自動(dòng)化檢測(cè)甲醇（99.8%）－80℃至少固定3dAnti-CD71-FITCAnti-CD61-PEPIRNase生物標(biāo)準(zhǔn)品—伯氏瘧原蟲(chóng)感染的紅細(xì)胞模仿MN調(diào)節(jié)PMT電壓調(diào)節(jié)補(bǔ)償血樣固定標(biāo)記染色質(zhì)控FCM體內(nèi)微核自動(dòng)化檢測(cè)甲醇（99.8%）Anti-CD7158FCM體內(nèi)微核自動(dòng)化檢測(cè)圖1利用CD71-(-)樣品和瘧原蟲(chóng)生物標(biāo)準(zhǔn)品建立FCM檢測(cè)小鼠外周血MN的模板。

FCM體內(nèi)微核自動(dòng)化檢測(cè)圖1利用CD71-(-)樣品和瘧原59ABCDFCM與常規(guī)顯微鏡檢MN結(jié)果相關(guān)性良好，同時(shí)獲得3個(gè)指標(biāo)：%RET、%MN-RET和%MN-NCE；

染色體斷裂劑和非整倍體誘導(dǎo)劑都能檢測(cè)出來(lái)；

重復(fù)性好，同樣的受試物劑量在本實(shí)驗(yàn)室和其他已知報(bào)道的實(shí)驗(yàn)室結(jié)果相當(dāng)；

排除一些假陽(yáng)性因素的干擾:使用RNase，排除聚集RNA的干擾；使用CD61抗體，排除血小板的干擾；使用CD71抗體特異標(biāo)記RET，排除常規(guī)Giemsa同染的嗜堿性小體等干擾。

三色FCM自動(dòng)化MN檢測(cè)系統(tǒng)符合IWGT的標(biāo)準(zhǔn)FCM體內(nèi)微核自動(dòng)化檢測(cè)ABCDFCM與常規(guī)顯微鏡檢MN結(jié)果相關(guān)性良好，同時(shí)獲得3個(gè)60基本滿足分子生物學(xué)和組合化學(xué)的大量候選化合物的毒性篩選

快速、高通量靈敏、客觀機(jī)制研究無(wú)種屬選擇性三色FCMvs

顯微鏡檢既可以檢出染色體斷裂劑，也可以檢出非整倍體誘導(dǎo)劑；研究量效關(guān)系和毒性閾值。嚙齒類骨髓和外周血；其他骨髓樣品不易獲取且脾臟亦有消除MN-RBC作用的物種的MN檢測(cè)（狗、靈長(zhǎng)類等）FCM亦能得出MN大小和分布的資料，即PI相關(guān)的熒光數(shù)值的大小（如DNA含量）

FCM體內(nèi)微核自動(dòng)化檢測(cè)基本滿足分子生物學(xué)和組合化學(xué)的大量候選化合物的毒性篩選快速61S2R1推薦的試驗(yàn)方法體內(nèi)Comet試驗(yàn)S2R1推薦的試驗(yàn)方法體內(nèi)Comet試驗(yàn)62體內(nèi)Comet試驗(yàn)體內(nèi)Comet試驗(yàn)63遺傳毒性新方法的研究遺傳毒性新方法的研究64體內(nèi)Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)Pig-a是N—乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體催化亞基的編碼基因，N—乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶催化細(xì)胞表面磷脂酰肌醇聚糖（glycosylphosphatidylinositol,GPI）錨的早期合成，GPI錨可將一些特殊的蛋白（如CD55、CD48等）連接到細(xì)胞表面。pig-a突變導(dǎo)致細(xì)胞表面GPI錨蛋白缺陷。在與GPI錨合成有關(guān)的基因中，只有pig-a位于X染色體上，其他基因都位于常染色體上，故GPI錨缺陷表型幾乎等同于pig-a突變?；驹眢w內(nèi)Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)Pig-a是N—乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶65體內(nèi)Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)體內(nèi)Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)66體內(nèi)Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)體內(nèi)Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)67體內(nèi)Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)體內(nèi)Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)68藥物遺傳毒性評(píng)價(jià)的指導(dǎo)原則1遺傳毒性試驗(yàn)方法的研究2藥物致癌性評(píng)價(jià)的概要3傳統(tǒng)和替代致癌試驗(yàn)的研究434主要內(nèi)容藥物遺傳毒性評(píng)價(jià)的指導(dǎo)原則1遺傳毒性試驗(yàn)方法的研究2藥物致癌69藥物致癌性評(píng)價(jià)的概要藥物致癌性試驗(yàn)的指導(dǎo)原則2.ICH指導(dǎo)原則

-S1A：藥物致癌試驗(yàn)的必要性-S1B：藥物致癌試驗(yàn)

-S1C：藥物只要試驗(yàn)的劑量選擇

-S1C(R)：藥物致癌試驗(yàn)劑量選擇的附件1.SFDA指導(dǎo)原則（國(guó)食藥監(jiān)注[2010]129號(hào)）

-《藥物致癌試驗(yàn)必要性的技術(shù)指導(dǎo)原則》<Technicalguidanceontheneedforcarcinogenicitystudiesforpharmaceuticals>

（等同于ICHS1A）藥物致癌性評(píng)價(jià)的概要藥物致癌性試驗(yàn)的指導(dǎo)原則2.ICH指70藥物致癌性評(píng)價(jià)的概要致癌性試驗(yàn)指南藥物致癌性評(píng)價(jià)的概要致癌性試驗(yàn)指南71藥物致癌性評(píng)價(jià)的概要ICHS1A和SFDA指導(dǎo)原則致癌試驗(yàn)要求

-持續(xù)使用6個(gè)月以上的藥物或頻繁、周期性、間歇性使用的藥物；

-如果有致癌傾向，一些短期使用藥物也要做致癌試驗(yàn)，

-某些劑型或輸藥系統(tǒng)會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)藥物長(zhǎng)期暴露的

時(shí)間窗要求

-批準(zhǔn)上市之前要做致癌試驗(yàn)；

-一些特殊關(guān)注的群體（如嬰幼兒）則需要在批準(zhǔn)（IV期臨床）前做

-用于嚴(yán)重甚至威脅生命的疾病的藥物可以在臨床批準(zhǔn)（IV期臨床）后做（沒(méi)滿意的可替代療法；特定人群如腫瘤病人較短的生存期；視適應(yīng)癥不同等情況而定）藥物致癌性評(píng)價(jià)的概要ICHS1A和SFDA指導(dǎo)原則致癌72藥物致癌性評(píng)價(jià)的概要

以下情況不需要致癌試驗(yàn)

-明確的基因型致癌物

-假定此類藥物具有跨種屬致癌性

-經(jīng)眼睛用藥和皮膚用藥

-藥物無(wú)明顯的結(jié)構(gòu)警示和全身暴露-藥物經(jīng)過(guò)鹽、酸或某些治療性基因改變

-改變之前的試驗(yàn)數(shù)據(jù)已存在

-改變后的PK、PD和毒性沒(méi)有明顯改變

-用于治療危及生命的疾病或患者存活期較短（＜2-3年）

生物制劑（蛋白療法）通常不要求致癌試驗(yàn)—casebycase（ICHS6）

ICHS1A和SFDA指導(dǎo)原則藥物致癌性評(píng)價(jià)的概要以下情況不需要致癌試驗(yàn)ICHS1A73遺傳毒性和致癌性的相關(guān)性基因型與非基因型致癌物的致癌性

-Ames陽(yáng)性的致突變劑中，80%具有致癌性

-由2年動(dòng)物致癌試驗(yàn)證實(shí)呈陽(yáng)性的致癌物中，50%具有遺傳毒性Correlationisnotperfect!2.藥物體外遺傳毒性試驗(yàn)的陽(yáng)性率偏高(Snyderetal.–MutatRes.2001,488:151-69)

-25%上市藥物具有遺傳毒性結(jié)果

-在體外染色體損傷試驗(yàn)中證實(shí)陽(yáng)性的藥物，在致癌試驗(yàn)中大部分呈陰性

-在體外染色體損傷試驗(yàn)中，高于治療濃度的藥物呈陽(yáng)性，通常與細(xì)胞毒性有關(guān)3.藥物的遺傳毒性和致癌性不完全相符的其他原因

-

體內(nèi)組織修復(fù)功能

-適應(yīng)性反應(yīng)

-遺傳多態(tài)性

-器官及系統(tǒng)之間相互作用等因素遺傳毒性和致癌性的相關(guān)性基因型與非基因型致癌物的致癌性Co74遺傳毒性和致癌性的相關(guān)性遺傳毒性和致癌性的相關(guān)性75藥物遺傳毒性評(píng)價(jià)的指導(dǎo)原則1遺傳毒性試驗(yàn)方法的研究2藥物致癌性評(píng)價(jià)的概要3傳統(tǒng)和替代致癌性試驗(yàn)的研究434主要內(nèi)容藥物遺傳毒性評(píng)價(jià)的指導(dǎo)原則1遺傳毒性試驗(yàn)方法的研究2藥物致癌76致癌性試驗(yàn)研究先導(dǎo)物研發(fā)靶點(diǎn)篩選候選物篩選I期臨床III期臨床II期臨床IV期臨床傳統(tǒng)兩年嚙齒類動(dòng)物致癌試驗(yàn)

-起始于上世紀(jì)60年代，首先用于檢測(cè)工業(yè)化學(xué)物質(zhì)的致癌性

-現(xiàn)用于檢測(cè)大多數(shù)慢性藥物的致癌性非傳統(tǒng)嚙齒類動(dòng)物致癌試驗(yàn)–轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

-1997年開(kāi)始用于檢測(cè)新藥的致癌性（ICHS1B）

-目前尚未用于首要和工業(yè)化合物的致癌性檢測(cè)GLP致癌性研究大鼠小鼠致癌性試驗(yàn)研究先導(dǎo)物研發(fā)靶點(diǎn)篩選候選物篩選I期臨床III期77傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn)

嚙齒類每個(gè)品系都有其病變背景并容易自發(fā)腫瘤，因此背景數(shù)據(jù)和經(jīng)驗(yàn)非常重要。大鼠-因?yàn)镾D大鼠的死亡率高，所以每組動(dòng)物數(shù)量要多（70只/性別/組）

-Wistar和F344大鼠存活率高些，但F344漸漸不受歡迎

-Wistar大鼠用的越來(lái)越多，50只/性別/組小鼠

-CD-1和B3C6F1在兩年致癌性試驗(yàn)中較常用

種屬和品系的選擇傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn)種屬和品系的選擇78傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn)

1個(gè)溶劑對(duì)照組，3個(gè)給藥組至少50只/性別/組，可考慮增加（如：70只/性別/組）-中期處死

-毒代樣品采集

-其他血樣采集

-兩年存活率低（終身試驗(yàn)）計(jì)劃給藥104周

理想情況下，在計(jì)劃處死時(shí)能有25只/性別/組以計(jì)劃用于臨床的給藥方式給藥；環(huán)境化學(xué)品、人用食品添加劑或動(dòng)物飼料補(bǔ)充劑等加入飲食中。

組數(shù)和每組動(dòng)物數(shù)傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn)組數(shù)和每組動(dòng)物數(shù)79傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn)

104周大鼠口服給藥致癌實(shí)驗(yàn)*若賦形劑不常用，可增加一個(gè)對(duì)照組；因?yàn)橛兄衅谄蕶z和毒代用動(dòng)物數(shù)量增加

Note：根據(jù)ICH指導(dǎo)原則，對(duì)于長(zhǎng)期用藥，6個(gè)月毒理試驗(yàn)加一個(gè)兩年致癌性試驗(yàn)足夠了，無(wú)需12個(gè)月的毒理試驗(yàn)。同時(shí)，需要用主實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物或獨(dú)立的TK組動(dòng)物進(jìn)行TK實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估?；镜膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)組別劑量（mg/kg）動(dòng)物中期剖檢毒代1對(duì)照組*064M/64F10M/10F4M/4F2低劑量組X64M/64F10M/10F4M/4F3中劑量組Y64M/64F10M/10F4M/4F4高劑量組Z64M/64F10M/10F4M/4F傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn)基本的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)組別劑量（mg/kg）動(dòng)物中80傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn)

“最高劑量或最大耐受劑量用來(lái)預(yù)測(cè)在致癌性試驗(yàn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生的最低毒性作用”-ICHS1C(R2)在最高推薦人用劑量時(shí)，嚙齒類與人類血清AUC（無(wú)毒藥物）的暴露比大于25:1吸收飽和—最大暴露限制劑量藥理學(xué)—鎮(zhèn)靜，食欲不振，血壓過(guò)低，影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的癲癇如果以下情況發(fā)生，采用限制劑量（藥物）：1500mg/kg

-人用劑量<500mg/d；無(wú)遺傳毒性；暴露水平高于最高推薦人用劑量的10倍

最大可行劑量

-飼料量的5%；最大灌胃量；局部耐受性高劑量的選擇傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn)高劑量的選擇81傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn)

展示不同劑量組藥物代謝動(dòng)力學(xué)、藥理學(xué)、毒理和致癌性范圍—各組間暴露不同很重要展示不產(chǎn)生毒性或未出現(xiàn)藥物相關(guān)腫瘤的劑量水平（定義閾值）通常使用給藥劑量或人類暴露的幾何或線性倍數(shù)通常低劑量接近臨床暴露水平低劑量和中劑量的選擇傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn)低劑量和中劑量的選擇82傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn)

對(duì)于藥品，F(xiàn)DA的CAC特別提出了一套評(píng)估方案，包括給藥原理和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)客戶必須提交與實(shí)驗(yàn)計(jì)劃給藥途徑一致的預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，此外還需提交遺傳毒理學(xué)數(shù)據(jù)，人類給藥和暴露劑量，蛋白結(jié)合信息，人體和動(dòng)物中代謝物的數(shù)據(jù)在試驗(yàn)開(kāi)始前，無(wú)任何其他機(jī)構(gòu)定期審查方案如果FDA與客戶意見(jiàn)一致或客戶同意接受美國(guó)FDA的建議，無(wú)論研究結(jié)果如何，F(xiàn)DA都認(rèn)為劑量的選擇適當(dāng)美國(guó)FDA致癌評(píng)估委員會(huì)（CAC）傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn)美國(guó)FDA致癌評(píng)估委員會(huì)（CAC）83傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn)毒理學(xué)監(jiān)測(cè)-攝食量

-體重

-臨床癥狀

-六個(gè)月后進(jìn)行觸診腫塊，一般每周一次，但可以低于此頻率。每周觸診可以對(duì)腫瘤的發(fā)病提供更好的評(píng)估對(duì)瀕死的動(dòng)物實(shí)行安樂(lè)死，早期處死要比晚期死亡更有價(jià)值預(yù)先設(shè)定好安樂(lè)死標(biāo)準(zhǔn)將加速?zèng)Q策進(jìn)程活體數(shù)據(jù)采集傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn)活體數(shù)據(jù)采集84傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn)

每個(gè)實(shí)驗(yàn)中藥物的暴露情況都必須進(jìn)行評(píng)估在實(shí)驗(yàn)中第6-12個(gè)月對(duì)暴露情況評(píng)估一次就足夠了通常取3-4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)劑量組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3-4只動(dòng)物進(jìn)行如果用主實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物，每只大鼠取一個(gè)樣品；對(duì)于小鼠用衛(wèi)星動(dòng)物組收集和分析對(duì)照組的樣品期望有獨(dú)立的毒代動(dòng)力學(xué)報(bào)告

毒代動(dòng)力學(xué)傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn)毒代動(dòng)力學(xué)85傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn)

醫(yī)藥品通常不進(jìn)行臨床病理的檢驗(yàn)，除非有項(xiàng)目特殊要求（STP,inpress2010）實(shí)驗(yàn)終期進(jìn)行臨床病理檢測(cè)沒(méi)有價(jià)值，而中期處死時(shí)進(jìn)行卻很有價(jià)值如果在實(shí)驗(yàn)早期沒(méi)有將臨床病理檢查定義好，在15個(gè)月內(nèi)也可以考慮進(jìn)行特定的檢查血涂片和骨髓涂片是否要進(jìn)行常規(guī)采集？

-可以作為保險(xiǎn)措施

-通常不進(jìn)行

-根據(jù)情況而定臨床病理學(xué)傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn)臨床病理學(xué)86傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn)

在全面評(píng)價(jià)潛在致癌性研究時(shí)統(tǒng)計(jì)學(xué)是一個(gè)重要的工具控制假陽(yáng)性錯(cuò)誤-對(duì)罕見(jiàn)腫瘤P<0.05

-對(duì)常見(jiàn)腫瘤P<0.01專題負(fù)責(zé)人必須監(jiān)測(cè)活體階段所有初步假設(shè)的統(tǒng)計(jì)因素，并減少偏離

對(duì)死亡率、腫塊、大體和組織病理學(xué)數(shù)據(jù)的評(píng)估是十分復(fù)雜的*來(lái)自活體階段人員以及病理專家的數(shù)據(jù)要準(zhǔn)確完整

-足夠的死亡率（到80~90周時(shí)尚有50%）

-早期處死瀕死動(dòng)物以保存組織

-跟蹤活體階段表明腫瘤

-確定可能的死亡原因*見(jiàn)指導(dǎo)原則《藥物慢性嚙齒類致癌試驗(yàn)的設(shè)計(jì)，分析和闡釋中的統(tǒng)計(jì)學(xué)》,FDACDER,2001統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)考慮的因素傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)考慮的因素87傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn)

每層架子上的各組動(dòng)物數(shù)目相等定期在房間內(nèi)交替架子，以減少視網(wǎng)膜退變?cè)诜枪ぷ鲿r(shí)間，采用低光照以減少視網(wǎng)膜退變給藥順序：對(duì)照組，低劑量組，中劑量組，高劑量組；避免交叉污染以同樣順序來(lái)采集毒代樣品高標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物管理是至關(guān)重要的保持同樣的飼料/墊料來(lái)源，密切監(jiān)測(cè)成分/污染物的變化

活體期間動(dòng)物的飼養(yǎng)與管理傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn)活體期間動(dòng)物的飼養(yǎng)與管理88傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn)

如果死亡率很高，可能一個(gè)劑量組全部早期處死更合適

FDA在通訊中提到：-在第100周以前，幸存動(dòng)物數(shù)降至15時(shí)，可考慮處死該給藥組或該性別所有動(dòng)物

-在某些方案中，當(dāng)幸存動(dòng)物數(shù)降至20時(shí)，停止對(duì)高劑量組該性別動(dòng)物的給藥；當(dāng)幸存動(dòng)物降至15時(shí)，處死高劑量組受影響的性別的所有動(dòng)物

-如果對(duì)照組的幸存動(dòng)物數(shù)下降至20或更少時(shí)，處死所有劑量組中受影響的性別的所有動(dòng)物

-在100周以后，如果高劑量組的幸存動(dòng)物降至15時(shí)，處死所有劑量組中受影響的性別的所有動(dòng)物

-早期處死一個(gè)劑量組不會(huì)實(shí)驗(yàn)無(wú)效劑量組的提前終止傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn)劑量組的提前終止89傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn)

早期處死與早期死亡-所有組織采集

-早期處死動(dòng)物比發(fā)現(xiàn)死亡動(dòng)物更有價(jià)值大鼠品系的選擇會(huì)影響動(dòng)物的壽命和到計(jì)劃處死時(shí)存活的比例

-Wistar大鼠存活率比SD大鼠高腫塊跟蹤-跟蹤活體階段的每一個(gè)腫塊

-與解剖結(jié)果的關(guān)聯(lián)

-通過(guò)顯微評(píng)價(jià)來(lái)跟蹤解剖時(shí)發(fā)現(xiàn)的腫塊（Peto試驗(yàn)要求）解剖傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn)解剖90傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn)

檢查方案中各組所有動(dòng)物的所有組織和腫塊跟蹤解剖中發(fā)現(xiàn)的所有腫塊的顯微診斷盡可能將大體觀察與顯微觀察結(jié)果關(guān)聯(lián)起來(lái)；但是“大體觀察與顯微觀察沒(méi)有關(guān)聯(lián)”也是可接受的，不是每個(gè)大體觀察都有相關(guān)聯(lián)的顯微觀察，重要的是你所觀察到的。如果可行的話，確認(rèn)腫瘤的原發(fā)部位將腫瘤歸類為“致命”與“非致命”：-有沒(méi)有可能是腫瘤促成的動(dòng)物提前死亡或死亡

-要求專業(yè)判斷

-要求做Peto試驗(yàn)

-計(jì)劃處死的動(dòng)物不需要記錄計(jì)劃處死前解剖的動(dòng)物死亡或?yàn)l死的原因顯微評(píng)價(jià)傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn)顯微評(píng)價(jià)91傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn)

致癌性實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)化合物在動(dòng)物體內(nèi)潛在致癌性的特定的非臨床安全性評(píng)價(jià)，旨在增進(jìn)人類的潛在致癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)

致癌性試驗(yàn)開(kāi)展時(shí)間取決于藥物的類型和關(guān)注程度

-通常在臨床試驗(yàn)第二，三階段進(jìn)行，很少在第IV階段（上市后）進(jìn)行

-通常104周的生物評(píng)價(jià)采用大鼠或小鼠進(jìn)行

-使用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或敏感的體外試驗(yàn)來(lái)推進(jìn)致癌性試驗(yàn)一些藥物可能不需要進(jìn)行致癌性試驗(yàn)

-細(xì)胞毒性抗癌藥物一般不需要進(jìn)行致癌性試驗(yàn)-生物技術(shù)藥物也可除外（ICHS6）專題負(fù)責(zé)人、毒理人員和統(tǒng)計(jì)人員作為一個(gè)團(tuán)隊(duì)，共同設(shè)計(jì)、執(zhí)行和評(píng)估-選擇種屬應(yīng)考慮藥代、毒代情況

-實(shí)驗(yàn)中每組必須有足夠的動(dòng)物，試驗(yàn)設(shè)計(jì)或執(zhí)行使偏離最小化

-劑量選擇是關(guān)鍵，必須顯示暴露范圍，從推薦人用劑量到MTD或最大可行劑量

-活體階段，死亡、解剖和顯微數(shù)據(jù)必須銜接

-對(duì)數(shù)據(jù)全面評(píng)價(jià)的統(tǒng)計(jì)方法必須適當(dāng)總結(jié)傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn)總結(jié)92替代致癌性試驗(yàn)ICHS1B潛在致癌性研究的指南1997年：1個(gè)兩年性致癌試驗(yàn)+1個(gè)替代模型的體內(nèi)試驗(yàn)

Trp53+/-（應(yīng)用于遺傳毒性的藥物）

rasH2（應(yīng)用于遺傳毒性和非遺傳毒性的藥物）

Tg.AC（局部采用，許多陽(yáng)性結(jié)果，遺傳不穩(wěn)定）

XPA-/-和XPA-/-xp53+/-新生鼠

開(kāi)始啟動(dòng)（Ito模型）p53+/-轉(zhuǎn)基因小鼠替代致癌性試驗(yàn)ICHS1B潛在致癌性研究的指南p53+/93替代致癌性試驗(yàn)應(yīng)用替代模型的原因減少動(dòng)物使用并降低費(fèi)用兩年致癌試驗(yàn)的問(wèn)題被廣泛認(rèn)知—肝細(xì)胞腫瘤；許多發(fā)現(xiàn)與人不相關(guān)提供有助于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的其他信息如有時(shí)間要求，可以縮短至9個(gè)月可以延長(zhǎng)試驗(yàn)直至III期結(jié)果顯示成功陽(yáng)性結(jié)果的幾率降低rasH2轉(zhuǎn)基因小鼠替代致癌性試驗(yàn)應(yīng)用替代模型