第二章細胞工程的理論根底山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院編輯ppt動物細胞與組織培養(yǎng)〔cellandtissueculture〕是動物細胞工程的重要技術(shù)根底。動物的細胞與組織培養(yǎng)是指從活的機體中取出組織或細胞，模擬機體內(nèi)生理條件，在體外建立無菌、適溫和一定營養(yǎng)條件等，使之生長和生存，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)。編輯ppt組織培養(yǎng)的概念組織培養(yǎng)這一名詞實際上是一個通用名詞，習(xí)慣上泛指所有的體外培養(yǎng)。根據(jù)培養(yǎng)物的不同可概括為三個不同概念：細胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)和器官培養(yǎng)。編輯pptA：細胞培養(yǎng)：將組織塊用機械方法或酶解法別離成單個細胞，做成細胞懸液，再培養(yǎng)于固體基質(zhì)上，成單層細胞生長，或在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)培養(yǎng)的技術(shù)稱為細胞培養(yǎng)。編輯pptB：組織培養(yǎng)：將活體的一小片組織放在盛有培養(yǎng)液的玻璃或塑料培養(yǎng)器皿中，待組織塊粘著后，沿底面平面移動生長的過程稱為組織培養(yǎng)。從組織塊中生長出來的仍然是細胞，細胞在生長的同時也發(fā)生移動，至使組織培養(yǎng)難以長時間維持其原有結(jié)構(gòu)，結(jié)果也就成了細胞培養(yǎng)。編輯pptC：器官培養(yǎng)：是指采取某些措施使器官的原基、器官的一局部或整個器官在體外存活、生長，并保持其原有結(jié)構(gòu)和功能的培養(yǎng)技術(shù)。編輯ppt體外培養(yǎng)的種類編輯ppt二、細胞培養(yǎng)的現(xiàn)實意義編輯ppt

生物技術(shù)上：生產(chǎn)各種生技術(shù)產(chǎn)品如：狂犬病、小兒麻痹癥等病毒疫苗，表皮生長因子及干擾素、白細胞介素等生長因子及單克隆抗體等。科學(xué)研究上：在病毒學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)、腫瘤學(xué)等方面。臨床醫(yī)學(xué)上：胎兒的遺傳性疾病分析，藥物篩選及某些疾病的治療等編輯ppt三、細胞培養(yǎng)的優(yōu)點編輯ppt

1.研究的對象是活細胞

在實驗過程中，根據(jù)要求可始終保持細胞活力，并可長時間監(jiān)控、檢測甚至定量評估一局部活細胞的情況，包括活細胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生命活動等。

編輯ppt

2.研究條件可以人為控制

可以根據(jù)需要，控制包括pH、溫度、氧氣、二氧化碳、張力等物理化學(xué)的條件，同時，可以施加化學(xué)、物理、生物等因素作為條件而進行實驗觀察，這些因素同樣可以處于嚴格控制之下。編輯ppt3.研究的樣本可以到達比較均一性通過細胞培養(yǎng)一定代數(shù)后，所得到的細胞系那么可以到達均一性而屬于同一類型的細胞，需要時，可采用克隆化等方法使細胞到達純化。編輯ppt4.研究內(nèi)容便于觀察、檢測和記錄

采用各種研究技術(shù)、記錄方法：

研究:倒置生物顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、流式細胞術(shù)、激光共焦顯微鏡、免疫組織化學(xué)、原位雜交、同位素標記--

記錄:攝影照片、縮時電影、電視--編輯ppt5.研究的范圍比較廣泛學(xué)科多：細胞學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、生物化學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等對象廣：

各種動物：低等動物--高等動物--人類

一種動物：不同年齡--

不同組織--

正?；虍惓！材[瘤--〕

編輯ppt6.研究的費用相對較經(jīng)濟

可提供大量、同一時期、重復(fù)性好的、生物學(xué)性狀相似的實驗對象編輯ppt四、細胞培養(yǎng)的缺點編輯ppt

現(xiàn)人工模擬體內(nèi)環(huán)境的技術(shù)已經(jīng)很高,

但,人工所模擬的條件與體內(nèi)實際情況

仍不完全相同.

當細胞被置于體外培養(yǎng)后,

生活在缺乏動態(tài)平衡的環(huán)境中,

久了，必然發(fā)生變化.編輯ppt

因此，對于體外培養(yǎng)的細胞，應(yīng)該把他們視作一種既能保持動物體內(nèi)原細胞一定的性狀、結(jié)構(gòu)和功能又具有某些改變的特定的細胞群體，而不能將之與體內(nèi)的細胞完全等同。編輯ppt五、細胞培養(yǎng)的工作原那么編輯ppt有標準化的工作方法培養(yǎng)用的液體極多〔如培養(yǎng)液、胰蛋白酶、HANKS液及抗菌素等〕，應(yīng)由專人負責(zé)，并保證做到按規(guī)程行事，配制濃度準確，滅菌可靠，所有配好的溶液瓶上都要標明名稱、濃度、消毒與否和制備日期等。一切培養(yǎng)用品都要有固定的存放點，防止雜亂無章，其中尤其重要的是：培養(yǎng)用品與非培養(yǎng)用品應(yīng)嚴格分開，已消毒品與未消毒品應(yīng)分別存放。編輯ppt第二節(jié)組織培養(yǎng)的細胞生物學(xué)編輯ppt一、體內(nèi)外細胞的差異和分化編輯ppt〔一〕體內(nèi)外細胞的差異培養(yǎng)細胞最多見的表現(xiàn)是：失去原有組織結(jié)構(gòu)和細胞形態(tài)，分化減弱或不顯，出現(xiàn)類似“反祖〞現(xiàn)象；表現(xiàn)為細胞趨單一化，或獲得不死性，或變成具有惡性性狀的細胞群。編輯ppt1.與體內(nèi)主要不同

相對孤立、相對單一

缺乏體內(nèi)的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)

和細胞相互間的影響

編輯ppt2.主要表現(xiàn)

失去原有組織結(jié)構(gòu)和細胞形態(tài)

分化減弱或不顯

細胞趨向單一化；3.提示

要正確認識體外培養(yǎng)細胞

是一種特定條件下生長的細胞群體。

編輯ppt（二）培養(yǎng)細胞的分化1．不適應(yīng)(Deadaption)：表現(xiàn)為，細胞在原體內(nèi)時所擁有的分化特性減弱或不顯，如肝細胞產(chǎn)生酪氨酸轉(zhuǎn)移酶(TyrosineAminotranserase)特性的喪失.2．脫分化或去分化(Dedifferentiation)細胞也可能出現(xiàn)脫分化或去分化，即細胞失掉發(fā)生分化的能力。編輯ppt編輯ppt二、培養(yǎng)細胞形態(tài)分類編輯ppt體外細胞培養(yǎng)物的生長類型

按生長方式:2型粘附型細胞:附著在某一固相支持物外表才能生長的細胞。懸浮型細胞:不必附著于固相支持物外表，而在懸浮狀態(tài)下即可生長的細胞。絕大多數(shù)有機體細胞屬粘附型細胞，只有少數(shù)細胞類型如某些腫瘤細胞和白細胞可在懸浮狀態(tài)下生長。編輯ppt貼附(粘附)型細胞

粘附:是大多數(shù)有機體細胞在體內(nèi)

生存和生長發(fā)育的根本存在方式含義兩方面結(jié)果基于粘附特性，使細胞與細胞之間相互結(jié)合形成組織，

有機體的絕大多數(shù)細胞必須

粘附于一固相外表

才能生存和生長。

編輯ppt培養(yǎng)時：這些細胞被放到體外環(huán)境中以后,同樣需要粘附于某一固相外表才能生存和生長，因而屬于粘附型細胞。粘附(錨定或錨著)依賴型(性)細胞：唯有粘附于固相外表才能生存的細胞編輯ppt

類型

細胞在體內(nèi)、外的粘附方式：存在差異

體內(nèi)：粘附是全方位

外形具有復(fù)雜的立體特征

體外：多數(shù)情況，細胞只有一個附著平面

外形一般與體內(nèi)時明顯不同

按照培養(yǎng)細胞粘附生長時的主要形態(tài)，可分為幾大類型

編輯ppt分類

根據(jù)形態(tài)大致的不同，主要2類：

上皮細胞型成纖維細胞型

其它，不定型編輯ppt上皮細胞型

名稱：僅形態(tài)上似體內(nèi)，實際上不完全等于--來源：來源于外胚層，內(nèi)胚層細胞如：皮膚及其衍生物消化道，乳腺，肺泡上皮性腫瘤形態(tài)：類似體內(nèi)的上皮細胞扁平，不規(guī)那么多角形，中有圓形核編輯ppt生長特點

易相連成片

相靠—緊密相連—成薄層—

鋪石狀

生長時呈膜狀移動

很少脫離細胞群而單個活動

體外培養(yǎng)細胞類型〔1〕——上皮細胞型編輯ppt成纖維細胞型

名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細胞類似的來源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織如：真正的成纖維細胞心肌，平滑肌，成骨細胞，血管內(nèi)皮形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細胞的形態(tài)胞體梭形或不規(guī)那么三角形胞質(zhì)向外伸出2—3個長短不等的突起中有卵圓形核編輯ppt生長特點

排列成放射狀，漩渦狀

并不緊靠連成片，細胞—細胞接觸易斷開而

單獨行動游離的單獨的成纖維樣細胞，

常有幾個伸長的細胞突起體外培養(yǎng)細胞類型〔2〕——成纖維細胞型編輯ppt貼附生長型--類型1.與體內(nèi)同名的細胞不完全相同如：形態(tài)相似的成纖維細胞，可不同來源自同一動物不同組織的成纖維樣細胞相似但

開展趨向不同2.培養(yǎng)細胞的形態(tài)不穩(wěn)定條件改變，細胞形態(tài)可有變化編輯ppt培養(yǎng)細胞形態(tài)不穩(wěn)定

血清Hela高血清低血清

成纖維細胞樣上皮樣細胞

pH

Hela太酸或太堿標準pH

成纖維細胞樣上皮樣細胞

細胞密度3T3低密度高密度

成纖維細胞樣上皮樣細胞

生長狀態(tài)改變

懸浮或貼附懸浮貼附

圓形成纖維或上皮樣

轉(zhuǎn)化與否未轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化后

成纖維樣可成上皮樣編輯ppt懸浮生長型

概念

培養(yǎng)時不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長

或以機械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長來源

自血，脾或骨髓，尤以血中白細胞癌腫細胞也可能特點

在懸浮中生長良好細胞圓形，單個或小細胞團編輯ppt優(yōu)點

生存空間大，提供數(shù)量大傳代方便(不需消化)易于收獲可獲得穩(wěn)定狀態(tài)缺點觀察不方便很多細胞不能懸浮生長(尤以正常細胞)

編輯ppt三、培養(yǎng)細胞的生長特點編輯ppt〔一〕貼附〔二〕接觸抑制〔三〕密度抑制編輯ppt四、培養(yǎng)細胞的生長和增殖過程編輯ppt〔一〕組織培養(yǎng)細胞生命期(LifeSpanofCultureCells)所謂培養(yǎng)細胞生命期，是指細胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間。包括原代培養(yǎng)期、傳代培養(yǎng)期及衰退期。編輯ppt正常培養(yǎng)的細胞周期編輯ppt原代培養(yǎng)(PrimaryCulture)期也稱初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1-4周。特點：細胞呈活潑移動，可見細胞分裂，但不旺盛。與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動上相似性大。編輯ppt傳代期特點：在全生命期中此期的持續(xù)時間最長，細胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型。傳代：體內(nèi)細胞生長在動態(tài)平衡環(huán)境中，而組織培養(yǎng)細胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、皿或其它容器，生存空間和營養(yǎng)是有限的。當細胞增殖到達一定密度后，那么需要別離出一局部細胞和更新營養(yǎng)液，否那么將影響細胞的繼續(xù)生存，這一過程叫傳代。初代培養(yǎng)的細胞一經(jīng)傳代后便改稱做細胞系〔CellLine〕。編輯ppt衰退期特點：此期細胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。編輯ppt〔二〕體外培養(yǎng)細胞一代生存期潛伏期指數(shù)增生期停滯期所謂細胞的“一代〞是指從細胞接種到別離再培養(yǎng)的一段時間。編輯ppt〔三〕單個細胞的生長過程編輯ppt五、體外培養(yǎng)細胞的遺傳學(xué)特征〔一〕核型變化〔二〕永生化和惡變〔三〕細胞性別編輯ppt六、體外培養(yǎng)細胞的生存環(huán)境〔一〕無污染環(huán)境〔二〕溫度〔三〕氣體環(huán)境和氫離子濃度編輯ppt七、體外培養(yǎng)細胞生存所需根本物質(zhì)〔一〕糖〔二〕氨基酸〔三〕維生素〔四〕促生長因子〔五〕其它物質(zhì)編輯ppt第三節(jié)建立細胞系或細胞株編輯ppt一、體外培養(yǎng)細胞的種類和命名〔一〕初代培養(yǎng)初代培養(yǎng)又稱原代培養(yǎng)，即直接從體內(nèi)取出的細胞、組織和器官進行的第一次的培養(yǎng)物。一旦已進行傳代培養(yǎng)(5ubculture)的細胞，便不再稱為初代培養(yǎng)，而改稱為細胞系。編輯ppt〔二〕細胞系初代培養(yǎng)物開始第一次傳代培養(yǎng)后的細胞，即稱之為細胞系。有限細胞系無限細胞系編輯ppt(三)克隆細胞株

從一個經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細胞系用單細胞別離培養(yǎng)或通過篩選購方法，由單細胞增殖形成的細胞群，稱細胞株。編輯ppt(四)二倍體細胞培養(yǎng)細胞染色體數(shù)目具有與原供體二倍細胞染色體數(shù)相同或根本相同(2n細胞占75＞或80％以上)的細胞群，稱二倍體細胞培養(yǎng)。二倍體細胞在正常情況下具有限生命期，故屬有限細胞系。編輯ppt(五)腫瘤細胞系或株是現(xiàn)有細胞系中最多的一類，我國已建立細胞系主要為這類細胞。腫瘤細胞系多由癌瘤建成，多呈上皮細胞型，常已傳幾十代或百代以上，并并具有不死性和異體接種致瘤性。編輯ppt對已建成的各種細胞系或細胞株習(xí)慣上都給以名稱；細胞的命名無嚴格統(tǒng)一規(guī)定，大多采用有一定意義縮寫字或代號表示。但不管什么形式，均不宜太長，以便記憶和了解，今列舉以下幾種代表性的細胞名稱供參考；HeLa：為供體患者的性名(來源于宮頸癌)CHO：中國地鼠卵巢細胞(ChineseHamsterOvary)宮—743：富頸癌上皮細胞，1974年3月建立NIH3T3；美國國立衛(wèi)生研究所(NationalInstituteofHealth)建立,每3天傳代一次，每次接種3×106細胞／毫升。〔六〕細胞系或細胞株的命名編輯ppt二、建立細胞系〔或株〕的要求〔一〕組織來源〔二〕細胞生物學(xué)檢測〔三〕培養(yǎng)條件和方法編輯ppt三、已建立細胞系或株的簽定、管理和使用培養(yǎng)簡歷：組織來源日期、物種、組織起源、性別、年齡、供體正?；虍惓＝】禒顟B(tài)、細胞已傳代數(shù)等。凍存液：培養(yǎng)基和防凍液名稱。細胞活力：融解前后細胞接種存活率和生長特性。培養(yǎng)液：培養(yǎng)基種類和名稱(一般要求不含抗生素)，血清來源和含量。細胞形態(tài)：類型，如為上皮或成纖維細胞等。核型：二倍體或多倍體，標記染色體的有無。無污染測驗：包括細菌、真菌、支原體、原蟲和病毒等。物種檢測：檢測同功酶，主要為G6PD和LDH，以證明細胞有否交叉污染。免疫檢測：一兩種血清學(xué)檢測。細胞建立者：建立者性名；檢測者姓名。編輯pptC1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL9H6E3B+y(u%r#oWlTiQeNbJ8G5D1A-x*t$qYnVkSgPdMaI7F3C0z)v&s!pXmUiRfOcK9H6E2B+y(u%rZoWlThQeNbJ8G4D1A-w*t$qYnVjSgPdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ7G4D1z-w*t!qYnVjSgOdLaI6F3C0y)v%s#pXlUiRfNcK8H5E2A+x(u$rZnWkThPeMbJ7G4C1z-w&t!qYmVjRgOdL9I6F3B0y(v%s#oXlUiQfNcK8H5D2A+x*u$rZnWkShPeMaJ7G4C1z)w&t!pYmVjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRgOcL9H6E3B+y(v%nWkShPeMaJ7G4C1z)w&t!pYmVjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnWkShPdMaJ7F4C1z)w&s!pYmUjRgOcL9H6E3B+y(v%r#oWlTiQeNbK8G5D1A-x*t$qZnVkSgPdMaI7F4C0z)v&s!pXmUjRfOcK9H6E2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)v&s#pXmUiRfOcK9H5E2B+x(u%rZoWkThQeMbJ8G4D1z-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK9H5E2A+t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)v&s#pXmUiRfOcK9H5E2B+x(u%rZoWkThQeMbJ8G4D1A-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK9H5E2A+x(u$rZoWkThPeMbJ7G4D1z-w&t!qYmVjSgOdLH5E2B+x(u%rZoWlThQeMbJ8G4D1A-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK9H5E2A+x(u$rZoWkThPeMbJ7G4D1z-w&t!qYmVjSgOdL9I6F3B0y)v%s#pXlUiQfNcK8H5E2A+x*u$rZnWkThPeMaJ7G4C1z-w&t!pYmVjRgOdL9I6E3B0y(v%s#oXlTiQfNbK8H5D2A-x*u$qZnWkShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkShPdMaI7F4C0zoWkThQeMbJ7G4D1z-w*t!qYmVjSgOdLaI6F3B0y)v%s#pXlUiQfNcK8H5E2A+x*u$rZnWkThPeMaJ7G4C1z-w&t!pYmVjRgOdL9I6F3B0y(v%s#oXlUiQfNbK8H5D2A+x*u$qZnWkShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkSdL9I6F3B0y(v%s#oXlUiQfNbK8H5D2A+x*u$qZnWkShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL9H6E3B+y(u%r#oWlTiQeNbJ8G5D1A-x*t$qYnVkSgPdMaI7F3C0z)v&s!pXmUjRfOcK9H6E2B+y(u%rZoWlThQeNbJ8G4D1A-w*t$qYnVjSgPdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ8G4D1z-w*t!qYnVjSgOdLaI6F3C0y)v%s#pXlUiRfNcK8H5E2A+x(u$rZnWkThPeMbJ7G4C1z-w&t!qYmVjRgOdL9I6F3B0y)v%s#oXlUiQfNcK8H5D2A+x*u$rZnWkShPeMaJ7G4C1z)w&t!pYmVjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C1z)w&s!pYmUjRgOcL9H6E3B+y(v%r#oWlTiQeNbK8G5D1A-x*t$qZnVkSgPdMaI7F4C0z)v&s!pXmUjRfOcK9H6E2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)v&s#pXmUiRfOcK9H5E2B+x(u%rZoWkThQeMbJ8G4D1z-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK9H5E2A+x(u$rZoWkThPeMbJ7G4D1z-w&t!qYmVjSgOdL9I6F3B0y)v%s#oXlUiQfNcK8H5D2A+x*u$rZnWkThPeMaJ7G4C1z-w&t!pYmVjRgOdL9I6E3B0y(v%s#oXlTiQfNbK8H5D2A-x*u$qZnWkShPdMaJ7F4C1z)w&s!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkShPdMaI7F4C0z)w&s!pXmUjRfOcL9H6E2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgPdMaI7F3C0z)v&s!pXmUiRfOcK9H6E2B+x(u%rZoWlThQeMbJ8G4D1A-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQe7F3C0z)v&s!pXmUiRfOcK9H6E2B+x(u%rZoWlThQeMbJ8G4D1A-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK5D1A-x*t$qYnVkSgPdMaI7F3C0z)v&s!pXmUiRfOcK9D2A-x*t$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL91z-w*t!qYmVjSgOdLaI6Ft$qZnVkShPdMaI7F4C0z)w&s!pXmUjy(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkSdL9I6E3B0y(v%s#oXlUiQfNbK8H5D2A+x*u$qZnWkShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5Dw&t!qYmVjRgOdL9I6F3B0y(v%s#oXhQeMbJ7G4D1z-w*t!qYmVjSgOdLaI6F3B0y)v%s#pXleMbJ8G4D1A-w*t$qYnVjSgPdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ7G4D1z-w*t!qYmVjSgOdLaI6F3B0y)v%s#pXlUiRfNcK8H5E2A+x(u$rZnWkThPaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ7G4D1z-w*t!qYmVjSgOdLaI6F3C0y)v%s#pXlUiRfNcK8H5E2A+x(u$rZnWkThPeMbJ7G4C1z-w&t!qYmVjNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ8rZnWkTdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ8G4D1z-w*t!qYnVjSgOdLaI6F3CqZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL9H6E3B+!qYmVjSgOdLaI6F3C0y)v%s#pXlUiRfNcK8D1A-w*t$qYnVjSgPdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2*t$qZnVk4D1A-w*t$qYnVjSgv&s!pXiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL9H6E3B+y(u%r#oWlTiQeNbJ8G5D1A-x*t$qZnVkSL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL9H6E3B+y(u%r#oWlTiQeNbK8G5D1A-x*t$qZnVkSgPdMaI7F4C0z)v&s!pXmUjRfOcK9H6E2B+y(u%rZoWlThQeNbJ8G4D1A-w*pUiQfNcK8H5D2A+x*u$rZnWkShPeMaJ7G4C1z)w&t!pYmVjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A