玻璃化法對(duì)香石竹離體莖尖的超低溫保存

香石竹，又名康乃馨和香石竹，是石竹科的一種多年生草本植物。原產(chǎn)于中海地區(qū)、南部歐洲和西亞?；ò攴枷?，在世界各地種植。目前對(duì)香石竹種質(zhì)資源的保存主要采用田間保存法和組織培養(yǎng)保存法。田間保存法不僅需要大量的人力、物力和財(cái)力,而且不可避免地受到各種自然災(zāi)害和人為的影響,最終可能造成珍貴品種資源的遺失或混雜;組織培養(yǎng)保存工作量大、費(fèi)用高,繼代培養(yǎng)易出現(xiàn)體細(xì)胞變異,不利于種質(zhì)資源的遺傳穩(wěn)定性,因此有必要探討新的種質(zhì)資源保存方法。超低溫保存是植物種質(zhì)保存的理想途徑,自從1973年Nag和Street首次成功地用液氮超低溫保存了胡蘿卜懸浮細(xì)胞后,迄今進(jìn)行超低溫保存的植物材料已達(dá)200余種。隨著種質(zhì)離體保存技術(shù)的發(fā)展,與傳統(tǒng)的超低溫保存方法相比,近年來(lái)發(fā)展較快的玻璃化法超低溫保存具有設(shè)備要求簡(jiǎn)單、材料處理步驟簡(jiǎn)便、效果和重演性好等優(yōu)點(diǎn),是目前較為理想的植物種質(zhì)資源長(zhǎng)期穩(wěn)定的保存方法,尤其適合組培物和莖尖培養(yǎng)物的保存,已經(jīng)成功應(yīng)用于幾十種植物的莖尖保存。本試驗(yàn)用玻璃化法進(jìn)行香石竹莖尖的超低溫保存,以期建立起香石竹莖尖的超低溫保存體系,為長(zhǎng)期穩(wěn)定保存香石竹種質(zhì)資源提供技術(shù)支持。1材料和方法1.1材料表面香石竹自育品種“云戀蝶”的組織培養(yǎng)苗。1.2正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)莖尖玻璃化超低溫處理的步驟為:無(wú)菌莖尖培養(yǎng)※預(yù)培養(yǎng)※裝載※脫水※液氮處理※化凍※去裝載※恢復(fù)培養(yǎng)。莖尖超低溫保存受多種因素的影響,本實(shí)驗(yàn)利用正交設(shè)計(jì)方法對(duì)其中一些重要的影響因子進(jìn)行優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)采用F測(cè)驗(yàn)及Tukey分析方法。其中包括預(yù)培養(yǎng)基中蔗糖濃度(A)、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間(B)、裝載液處理時(shí)間(C)、玻璃化液(PVS2)處理時(shí)間(D)等4個(gè)因素,上速因素按照L9(34)進(jìn)行正交設(shè)計(jì)(如表1),共9種處理,每個(gè)處理20個(gè)莖尖,3次重復(fù)。1.2.1莖段的預(yù)處理試驗(yàn)取繼代30d后的香石竹“云戀蝶”無(wú)菌組培苗,切取1cm的莖段放入MS+(0.3,0.5,0.7mol/L)蔗糖+5%二甲基亞砜(DMSO)+7g/L瓊脂培養(yǎng)基中,在培養(yǎng)溫度為25±2℃,每天光照光照強(qiáng)度為預(yù)培養(yǎng)1.2.3脫水處理設(shè)計(jì)將莖尖從裝載液中轉(zhuǎn)移到玻璃化液(PVS2:MS+30%甘油+15%乙二醇+15%DMSO+0.4mol/L蔗糖)中進(jìn)行脫水處理,此過(guò)程需在0℃下進(jìn)行,處理時(shí)間設(shè)定為20、40、60min3個(gè)級(jí)別。1.2.5冷凍1.2.6ms/ms液培養(yǎng)方法經(jīng)過(guò)化凍后,當(dāng)凍存管中的冰剛剛化時(shí),棄去PVS2液,先用去裝載溶液MS+1.2mol/L蔗糖的洗滌液洗滌,期間輕輕搖動(dòng),棄培養(yǎng)液,再用同樣的培養(yǎng)液洗滌2次,每次10min。1.2.7培養(yǎng)基和光照經(jīng)化凍和洗滌后的香石竹“云戀蝶”莖尖接在MS+BA0.2mg/L+NAA0.1mg/L,pH值為6.0的培養(yǎng)基上,在培養(yǎng)溫度為25±2℃,每天光照10h,光照強(qiáng)度為2000lx,進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)。1.2.8再生苗的葉綠素含量、可溶性蛋白含量、pod值記錄香石竹莖尖的成活率及恢復(fù)生長(zhǎng)的時(shí)間,并在繼代2次后測(cè)定超低溫保存后的再生苗與常溫保存試管苗的葉綠素含量、可溶性蛋白含量、POD值的差異。試驗(yàn)結(jié)果用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。成活率(%)=玻璃化超低溫保存后成活的莖尖數(shù)/保存的總莖尖數(shù)×100。2結(jié)果與分析2.1文獻(xiàn)中的成因?qū)︻A(yù)培養(yǎng)基中蔗糖濃度、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、裝載液處理時(shí)間、PVS2溶液處理時(shí)間等4個(gè)因素按照L9(34)進(jìn)行正交處理,結(jié)果如表2所示。從表2可見(jiàn),處理1、處理3與其他處理均達(dá)到顯著差異水平,處理1成活率最高,44.13%;處理3成活率次之;成活率最低的為處理7。因此,預(yù)培養(yǎng)基中蔗糖濃度為0.5mol/L,預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為1d,裝載時(shí)間為40min,PVS2液處理時(shí)間為40min,莖尖的成活率最高。分析各個(gè)因素對(duì)處理后成活率的影響(表3)可知,對(duì)于超低溫處理后的莖尖成活率,各個(gè)因素水平之間均達(dá)到了極顯著差異。從極差分析中可以看出,4個(gè)因素對(duì)莖尖成活率的影響程度為:預(yù)培養(yǎng)時(shí)間>裝載時(shí)間>PVS2處理時(shí)間>預(yù)培養(yǎng)基蔗糖濃度。比較極差分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),預(yù)培養(yǎng)時(shí)間是影響超低溫處理后莖尖成活率的主要因素,而預(yù)培養(yǎng)基蔗糖濃度對(duì)莖尖成活率影響較小。2.2超低溫處理對(duì)香石竹苗生長(zhǎng)的影響香石竹莖尖經(jīng)液氮保存后接種在培養(yǎng)基上約7~14d,成活的莖尖會(huì)逐漸轉(zhuǎn)成淡黃色(圖1-A),未成活的莖尖則發(fā)生漂白或褐變(圖1-B),繼續(xù)培養(yǎng)20~30d后莖尖成活,慢慢分化不定芽(圖1-C),繼代1~2次后長(zhǎng)成比較健壯的再生植株(圖1-D),與超低溫處理前后的香石竹苗從外觀和形態(tài)上并無(wú)明顯區(qū)別。2.3葉綠素含量測(cè)定結(jié)果通過(guò)對(duì)玻璃化超低溫保存后香石竹再生苗與常溫苗植株葉片中葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量可溶性蛋白含量、POD活力等5個(gè)值的測(cè)定,結(jié)果如表4所示。從表4可見(jiàn),超低溫再生苗與其常溫苗的生理生化指標(biāo)基本一樣,其葉綠素和可溶性蛋白含量以及POD活力雖有差異,但未達(dá)到顯著性水平,這在一定程度上保證了遺傳的穩(wěn)定性。3討論3.1不同保護(hù)劑pvs2溶液預(yù)處理蔗糖對(duì)于提高植物組織的抗寒性有著重要的作用,而且預(yù)培養(yǎng)對(duì)提高超低溫保存后的成活率有很大的影響,它使保存的材料達(dá)到最適合于超低溫保存的生理狀態(tài),主要是提高分裂細(xì)胞的比例和減少細(xì)胞內(nèi)自由水含量,增強(qiáng)細(xì)胞的抗寒力。脫水時(shí)間取決于材料的特性,包括植物的基因型、抗凍性及細(xì)胞的年齡、生理狀態(tài)等。裝載液預(yù)處理則是PVS2溶液快速脫水前必不可少的一步,它起到必要的滲透保護(hù)作用;PVS2溶液是玻璃化冰凍保護(hù)劑,同時(shí)其毒性成分(DMSO)又可能會(huì)對(duì)材料造成毒害,而且PVS2溶液處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也可能會(huì)導(dǎo)致材料的過(guò)度脫水而使細(xì)胞受損。為優(yōu)化玻璃化超低溫保存體系,本試驗(yàn)采用了正交設(shè)計(jì)方法,對(duì)幾個(gè)主要的因素進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果顯示:采用高糖(0.5mol/L)預(yù)培養(yǎng)1d,室溫下用裝載液裝載40min,0℃下用冰凍保護(hù)劑PVS2處理40min可以避免超低溫保存對(duì)香石竹造成的冷害,同時(shí)可以對(duì)香石竹莖尖進(jìn)行誘導(dǎo)脫水,大大提高了超低溫保存的成活率其中,預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)超低溫處理后莖尖的存活率影響最為明顯。這在Halmagyi研究發(fā)現(xiàn)將香石竹品種“Pallas”莖尖接種在MS+0.5mol/L的蔗糖培養(yǎng)基上,24℃預(yù)培養(yǎng)1d,凍存率較高試驗(yàn)中也得到了證明。3.2玻璃苗的來(lái)源解凍后莖尖的恢復(fù)培養(yǎng)一般是在弱光或黑暗條件下進(jìn)行培養(yǎng),再轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基上正常光照下培養(yǎng),以減少莖尖褐變及褐變對(duì)生長(zhǎng)分化的阻礙,提高莖尖的成活率。但香石竹組培苗易玻璃化,且玻璃苗絕大多數(shù)來(lái)自莖尖或莖切段培養(yǎng)物的不定芽,而光照則可以顯著降低玻璃苗百分率。本實(shí)驗(yàn)將經(jīng)化凍和洗滌后的香石竹“云戀蝶”莖尖在培養(yǎng)溫度為25±2℃,每天光照10h,光照強(qiáng)度為2000lx,進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng),其對(duì)莖尖成活率的影響需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。3.3超低溫保存的材料選擇植物種質(zhì)資源保存時(shí)特別要注意保存材料的遺傳穩(wěn)定性,否則保存就失去了意義。而保存材料的選擇至關(guān)重要,因?yàn)椴煌牟牧线z傳組成并不一定完全相同[12~15]。莖尖分生組織由于細(xì)胞分化程度小,在植物保存后的再生過(guò)程中,比其它細(xì)胞培養(yǎng)物的遺傳性穩(wěn)定[16~17],所以成為超低溫保存的一種理想材料,而且具有其獨(dú)特的優(yōu)越性,凍存的莖尖分生組織可以直接形成小植株,既可快速地進(jìn)行無(wú)性繁殖,又減少了材料的遺傳變異,尤其對(duì)那些易產(chǎn)生體細(xì)胞無(wú)性系變異或營(yíng)養(yǎng)繁殖的作物來(lái)說(shuō),莖尖分生組織超低溫保存更是較理想的保存方法。本研究對(duì)香石竹種質(zhì)超低溫保存后的生理指標(biāo)進(jìn)行了檢驗(yàn),其與未凍存的植株比較各項(xiàng)指標(biāo)都無(wú)顯著差異,證明了莖尖分生組織是種質(zhì)超低溫保存的理想材料。此外,超低溫保存過(guò)程中,材料在液氮中保存的時(shí)間長(zhǎng)短可能不是影響保存效果的因素。生物材料在液氮條件下,其生理代謝基本停止,所以保存時(shí)間長(zhǎng)短不會(huì)影響保存結(jié)果。保存1d和保存10個(gè)月的櫻桃在保存效果上沒(méi)有明顯區(qū)別,香蕉在液氮中保存時(shí)間的長(zhǎng)短不影響保存效果。至于超低溫保存過(guò)程給材料造成的損傷及其對(duì)保存效果的影響,有必要從細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)上對(duì)其進(jìn)行探討。1.2.2莖尖的裝卸取出預(yù)培養(yǎng)的莖段,在無(wú)菌條件下切取2~3mm大小