黃連中寒性物質(zhì)的實驗研究

黃連的有效成分主要是各種堿，如小堿、黃連堿、巴氏劑、根堿和表小堿。其中，小堿含量最高，約為5%8%。通過實驗檢測黃連生物堿和其他成分藥理藥性作用,前景廣闊。1生物技術(shù)D101樹脂(購于南京),高效液相色譜儀(島津),KQ5200DA型數(shù)控超聲波清洗器(昆明市超聲儀器有限公司),大鼠(購于重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司),數(shù)字溫度計(購于重慶君得萊醫(yī)療器械有限公司)。黃連須采自于重慶石柱縣,經(jīng)西南大學(xué)藥學(xué)院李學(xué)剛(研究員)鑒定,酵母(購于番禺梅山-馬利酵母有限公司制造),藥根堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿(成都曼思特生物科技有限公司),乙腈為色譜純,其它試劑均為分析純。2實驗方法2.1流動相乙腈—HPLC色譜條件HypersilODS2色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),流動相乙腈—磷酸二氫鉀(38:62),流速1mL·min-1,柱溫30℃,檢測波長343nm,進(jìn)樣量:25μL。2.2對照品溶液的制備精密稱取一定量的藥根堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿,用80%甲醇充分超聲溶解,精確吸取1mL置10mL容量瓶中,用甲醇最終稀釋成藥根堿29.28μg·mL-1、黃連堿18.4μg·mL-1、巴馬汀40.08μg·mL-1、小檗堿32.32μg·mL-1的對照品溶液。2.3沉淀沉淀液的制備黃連須用0.5%的硫酸水浸泡24小時,倒出浸提液,沉降泥沙后取其上清液,加氯化鈉鹽析得到沉淀。將沉淀物和D101樹脂按固-固2:1上柱,取沉淀按1:50加沸水溶解,取溶解液按1:100(固-液比)上100mLD101樹脂柱,開始從柱上流下的過柱液為無色,當(dāng)流出液出現(xiàn)黃顏色時開始收集過柱液,經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮后加氯化鈉鹽析得復(fù)合生物堿。2.4樹脂上樹脂的蒸發(fā)吸附黃連須浸提液飽和后的D101樹脂柱上樹脂是完全變?yōu)楹谏?用工業(yè)酒精對D101樹脂柱進(jìn)行梯度洗脫,收集洗脫液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干后得黑色物質(zhì)。2.5動物測試2.5.1復(fù)合提取液組升溫劑的配置,取一定量的干酵母與滅菌水均勻溶解,最終配置成含干酵母20%的水溶液,放置冰箱中備用。清熱藥物的配置,復(fù)合生物堿和黑色物質(zhì)分別配成600mg·Kg-1、300mg·Kg-1、150mg·Kg-1三個劑量組。每鼠灌胃量0.02mg·mL-1,每只灌胃4mL。2.5.2皮下注射酵母的篩選取32只SD大鼠,雄性,體重在250±10g左右,分為8組,1組空白對照組(不打酵母),剩下7組皮下注射酵母。其中1組為發(fā)熱組,其余6組為實驗藥物組。2.5.3復(fù)合從皮上注射酵母實驗前適應(yīng)喂養(yǎng)2天后,進(jìn)行正常體溫檢測,通過文獻(xiàn)知道溫度測試大鼠的正常體溫變化在36.5~37.3℃。每只大鼠按10mg·Kg-1背部皮下注射酵母2-3小時后,記錄當(dāng)時體溫?？瞻讓φ战M和發(fā)熱組灌胃生理鹽水,其余6組灌胃配置好的藥物,分別為600mg·L-1、300mg·L-1、150mg·L-1三個劑量組(復(fù)合生物堿)和相同三個劑量(黑色物質(zhì))。灌胃后檢測各時間段體溫,結(jié)果如表1。2.5.4統(tǒng)計處理試驗數(shù)據(jù)以±s表示,利用SPSS11.5進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和方差分析檢驗。3黑色物質(zhì)和復(fù)合氧化物組溫度的變化用HPLC檢測黑色清熱物質(zhì)和復(fù)合生物堿成分色譜圖,結(jié)果如圖1、2。從上表可知,空白組大鼠體溫均在正常范圍內(nèi)。注射酵母后,各組體溫與空白對照組在4小時已經(jīng)有明顯升高,說明造模成功。在2.5~4小時內(nèi)體溫迅速上升,發(fā)熱組有明顯的發(fā)熱趨勢,在注射酵母4小時后體溫開始上升到高峰,然后體溫有逐漸下降,與正常對照組比較,兩者之間有顯著差異。從灌胃后開始計時,單獨對比黑色物質(zhì)組和復(fù)合生物堿組溫度隨時間變化趨勢,如圖3、4所示。從圖中可知,灌胃1.5h左右溫度達(dá)到最高,但黑色物質(zhì)隨后的降溫效果明顯,而復(fù)合生物堿組溫度基本不變。經(jīng)過HPLC分析復(fù)合生物堿的成分可知,小檗堿、藥根堿、巴馬亭、黃連堿的含量分別為70.1%、8.4%、6.9%、10.2%;而黑色物質(zhì)的成分中僅含小檗堿和巴馬汀僅占3.72%,不含其他生物堿。因此,推斷用來降低大鼠體溫的物質(zhì)不是黃連生物堿,而是黃連中的大寒性物質(zhì),這種寒性物質(zhì)的成分還不確定,有待進(jìn)一步實驗分析認(rèn)定。4麻黃須中原則通過本實驗,能夠?qū)ⅫS連須中的復(fù)合生物堿和構(gòu)成黃連寒性的黑色物質(zhì)分離。實驗結(jié)果顯示,黃連須中生物堿雖有抗菌作用但沒有清熱降溫作