第2節(jié)基因工程的基本操作程序?qū)W有目標(biāo)——課標(biāo)要求必明1．闡述基因工程的原理和基本操作程序。2．針對(duì)人類生產(chǎn)或生活中的某一需求，選取適當(dāng)?shù)幕蚬こ痰募夹g(shù)和方法，嘗試設(shè)計(jì)獲得某一轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的方案。3.嘗試進(jìn)行PCR的基本操作，并用電泳鑒定PCR的產(chǎn)物。記在平時(shí)——核心語句必背1．基因工程的基本操作程序：目的基因的篩選與獲取→基因表達(dá)載體的構(gòu)建→將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞→目的基因的檢測與鑒定。2．PCR反應(yīng)中需要提供DNA模板、分別與兩條模板鏈結(jié)合的2種引物、4種脫氧核苷酸和耐高溫的DNA聚合酶。PCR反應(yīng)中每次循環(huán)一般可分為變性、復(fù)性、延伸三步。3．基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的核心，基因表達(dá)載體是載體的一種，除了目的基因外，它還必須有啟動(dòng)子、終止子以及標(biāo)記基因等。4．將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和花粉管通道法。導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞常用顯微注射技術(shù)，導(dǎo)入微生物細(xì)胞常用感受態(tài)細(xì)胞法(Ca2＋處理法)。續(xù)表[主干知識(shí)梳理]一、目的基因的篩選與獲取1．目的基因(1)概念：用于改變

或獲得

等的基因。(2)實(shí)例：培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉用到的目的基因是

。2．篩選合適的目的基因(1)較為有效的方法：從相關(guān)的

和

的基因中進(jìn)行篩選。(2)實(shí)例：在培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉之前，科學(xué)家不僅掌握了Bt基因的

，也對(duì)Bt基因的表達(dá)產(chǎn)物——

有了較為深入的了解。(3)認(rèn)識(shí)基因結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)方法：___________技術(shù)、

數(shù)據(jù)庫、__________工具。受體細(xì)胞性狀預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物Bt抗蟲蛋白基因已知結(jié)構(gòu)功能清晰序列信息Bt抗蟲蛋白DNA測序遺傳序列序列比對(duì)3．利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因(1)PCR的含義：PCR是________________的縮寫，它是一項(xiàng)根據(jù)________________的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)_________的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。(2)條件：DNA模板、分別與兩條模板鏈結(jié)合的2種

、4種

、耐高溫的

。(3)過程①變性：當(dāng)溫度超過90℃時(shí)，目的基因DNA

。②復(fù)性：當(dāng)溫度下降到50℃左右時(shí)，

通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA半保留復(fù)制目的基因引物脫氧核苷酸DNA聚合酶受熱變性后解為單鏈兩種引物③延伸：當(dāng)溫度上升到72℃左右時(shí)，溶液中_______________在耐高溫的____________的作用下加到引物的

端合成子鏈。④重復(fù)循環(huán)多次。(4)結(jié)果：每次循環(huán)后目的基因的量增加一倍，即成

形式擴(kuò)增(約為2n，其中n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù))。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建1．構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的(1)使目的基因在受體細(xì)胞中

，并且可以

給下一代。(2)使目的基因能夠

和發(fā)揮作用。4種脫氧核苷酸DNA聚合酶3′指數(shù)穩(wěn)定存在遺傳表達(dá)2．基因表達(dá)載體的組成(填圖)。3．基因表達(dá)載體的構(gòu)建首先用一定的

切割載體，使它出現(xiàn)一個(gè)切口，然后用

限制酶或_________________的限制酶切割含有目的基因的DNA片段，再利用___________將目的基因片段拼接到載體的切口處。限制酶同種能產(chǎn)生相同末端DNA連接酶三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1．轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并在受體細(xì)胞內(nèi)

和

的過程。2．目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法(1)目的基因?qū)胫参锛?xì)胞①花粉管通道法。a．用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入

中。b．在植物受粉后的一定時(shí)間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助

進(jìn)入

。維持穩(wěn)定表達(dá)子房花粉管通道胚囊②農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。a．農(nóng)桿菌的特點(diǎn)：農(nóng)桿菌自然條件下侵染

植物和

植物；農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒上的

能夠整合到所侵染細(xì)胞的

上。b．轉(zhuǎn)化方法：將目的基因插入農(nóng)桿菌

中，讓農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞。(2)目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞①常用方法：

法。②常用受體細(xì)胞：

。(3)目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞①方法：用

處理細(xì)胞，使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，然后將重組的基因表達(dá)載體導(dǎo)入其中。②常用受體細(xì)胞：原核細(xì)胞(使用最廣泛的是大腸桿菌)。雙子葉裸子T--DNA染色體DNATi質(zhì)粒的TDNA顯微注射受精卵Ca2＋四、目的基因的檢測與鑒定1．分子水平檢測(1)通過

等技術(shù)檢測受體細(xì)胞染色體DNA上是否插入了目的基因或檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA。(2)從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行

雜交，檢測目的基因是否翻譯成了蛋白質(zhì)。2．個(gè)體水平鑒定包括

實(shí)驗(yàn)，以確定是否有抗性及抗性程度?；蚬こ坍a(chǎn)品需要與

進(jìn)行比較等。PCR抗原－抗體抗蟲、抗病的接種天然產(chǎn)品活性[邊角知識(shí)發(fā)掘]1．(教材第80頁圖3-6變式訓(xùn)練)觀察基因表達(dá)載體構(gòu)建模式圖，寫出結(jié)構(gòu)①和②的名稱：①

，②

；物質(zhì)A和B的名稱：A.

，B.

。啟動(dòng)子終止子限制酶DNA連接酶2．(教材第81頁圖示變式訓(xùn)練)下圖為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法示意圖，請(qǐng)將①～④的操作序號(hào)填寫在圖中相應(yīng)的方框內(nèi)。①轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌②構(gòu)建表達(dá)載體③導(dǎo)入植物細(xì)胞④將目的基因插入染色體DNA中答案：A.②

B．④

C．①

D．③[教材問題提示]旁欄思考題1．(教材第79頁)mRNA不可以用PCR技術(shù)直接擴(kuò)增，需要將它逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進(jìn)行擴(kuò)增。由mRNA逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA的過程：第一步，逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補(bǔ)的DNA鏈，形成RNADNA雜交分子；第二步，核酸酶H降解RNADNA雜交分子中的RNA鏈，使之變成單鏈DNA；第三步，以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補(bǔ)的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子(見下圖)。2．(教材第80頁)采用總DNA注射法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，即將一個(gè)生物的總DNA提取出來，沒有進(jìn)行基因表達(dá)載體的構(gòu)建，通過注射或花粉管通道法導(dǎo)入受體植物，這種方法針對(duì)性差，完全靠運(yùn)氣，也無法確定哪些基因?qū)肓耸荏w植物。2．PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)，復(fù)性溫度的設(shè)定是成敗的關(guān)鍵。復(fù)性溫度過高會(huì)破壞引物與模板的堿基配對(duì)，復(fù)性溫度過低又會(huì)造成引物不能與DNA模板鏈的特定部位結(jié)合。復(fù)性溫度的設(shè)定與引物長度、堿基組成有關(guān)，假設(shè)引物的長度相同，在GC含量高時(shí)，對(duì)復(fù)性溫度的設(shè)定有什么要求？說明理由。提示：在引物的GC含量高時(shí)，設(shè)定的復(fù)性溫度要高一些。因?yàn)镈NA分子中G—C之間有三個(gè)氫鍵，A—T之間有兩個(gè)氫鍵。3．在利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因時(shí)，從第幾輪循環(huán)才會(huì)產(chǎn)生完整的目的基因(可用相關(guān)圖解解釋)?提示：第3輪，如圖所示：[師說重難]

一、利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因1．PCR反應(yīng)的過程2．PCR技術(shù)與生物體內(nèi)DNA復(fù)制的比較比較項(xiàng)目PCR技術(shù)DNA復(fù)制區(qū)別解旋方式DNA在高溫作用下變性解旋解旋酶催化場所細(xì)胞外(在PCR擴(kuò)增儀內(nèi))細(xì)胞內(nèi)(主要在細(xì)胞核內(nèi))酶耐高溫的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)DNA解旋酶、普通的DNA聚合酶等溫度條件需控制溫度，在較高溫度下進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)溫和條件合成的對(duì)象DNA片段或基因DNA分子聯(lián)系①模板：均需要脫氧核苷酸鏈作為模板進(jìn)行物質(zhì)合成②原料：均為四種脫氧核苷酸③酶：均需要DNA聚合酶進(jìn)行催化④引物：均需要引物，使DNA聚合酶從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸續(xù)表二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程1．用同一種限制酶或產(chǎn)生相同末端的限制酶切割含目的基因的DNA和質(zhì)粒，使其產(chǎn)生相同末端。2．將切下的目的基因片段與切開的質(zhì)?；旌?，再加入適量DNA連接酶，使目的基因插入質(zhì)粒的切口處，形成一個(gè)重組DNA分子(重組質(zhì)粒)。構(gòu)建過程如下圖所示：[在應(yīng)用中悟][典例1]下列關(guān)于PCR反應(yīng)體系中所加物質(zhì)作用的敘述，錯(cuò)誤的是 (

)A．耐高溫的DNA聚合酶用于催化DNA子鏈的合成B．引物使Taq酶能從引物的5′端延伸DNA鏈C．目標(biāo)DNA母鏈用作合成DNA復(fù)制的模板D．四種脫氧核苷酸為PCR提供能量和原料[解析]

通過PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí)，需要用耐高溫的DNA聚合酶催化單個(gè)脫氧核苷酸聚合形成DNA子鏈，A正確；在復(fù)制時(shí)，引物與DNA母鏈通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后，DNA聚合酶從引物的3′端開始延伸DNA鏈，因此DNA合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸，B錯(cuò)誤；PCR技術(shù)的原理是DNA雙鏈復(fù)制，DNA復(fù)制時(shí)兩條鏈均作為復(fù)制的模板，C正確；DNA合成的原料是四種脫氧核苷酸，同時(shí)兩個(gè)核苷酸連接時(shí)可釋放能量，D正確。[答案]

B[典例2]下列有關(guān)基因表達(dá)載體的構(gòu)建的說法，錯(cuò)誤的是 (

)①一個(gè)基因表達(dá)載體的組成只包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子②有了啟動(dòng)子才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA③終止子的作用是使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止④所有基因表達(dá)載體的構(gòu)建是完全相同的⑤必須在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行A．②③⑤

B．①④⑤C．①②⑤ D．③④[解析]基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的核心內(nèi)容，基因表達(dá)載體是載體的一種，除了目的基因外，它還必須有啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等，①錯(cuò)誤；啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，②正確；終止子控制著轉(zhuǎn)錄的結(jié)束，③正確；由于受體細(xì)胞有植物、動(dòng)物以及微生物之分，以及目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法不同，因此基因表達(dá)載體的構(gòu)建是不完全相同的，④錯(cuò)誤；基因表達(dá)載體的構(gòu)建必須在細(xì)胞外進(jìn)行，⑤錯(cuò)誤。[答案]

B[在訓(xùn)練中評(píng)]1．下列有關(guān)PCR技術(shù)的敘述，錯(cuò)誤的是 (

)A．在基因工程中，可通過該技術(shù)獲取目的基因B．要擴(kuò)增的目的基因的特異性取決于引物序列C．PCR反應(yīng)過程中需要解旋酶催化D．DNA體外擴(kuò)增的基本原理與體內(nèi)DNA復(fù)制相同解析：在基因工程中，可通過PCR技術(shù)獲取目的基因，A正確；要擴(kuò)增的目的基因的特異性取決于引物序列，B正確；PCR反應(yīng)過程中通過高溫解旋不需要解旋酶催化，C錯(cuò)誤；DNA體外擴(kuò)增的基本原理與體內(nèi)DNA復(fù)制相同，D正確。答案：C

2．基因工程的核心是構(gòu)建基因表達(dá)載體，下列不屬于載體作用的是 (

)A．載體能防止目的基因被受體細(xì)胞限制酶“切割”B．載體能協(xié)助目的基因在受體細(xì)胞中復(fù)制C．載體含有啟動(dòng)子和終止子協(xié)助目的基因表達(dá)D．載體具有標(biāo)記基因，便于篩選含目的基因的受體細(xì)胞解析：載體不能防止目的基因被受體細(xì)胞限制酶“切割”，A錯(cuò)誤；載體在受體細(xì)胞中能夠穩(wěn)定存在，并且具有自我復(fù)制能力，使目的基因數(shù)量擴(kuò)大，B正確；啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，能啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過程；終止子控制著轉(zhuǎn)錄的結(jié)束，所以載體含有的啟動(dòng)子和終止子可協(xié)助目的基因表達(dá)，C正確；載體具有標(biāo)記基因，標(biāo)記基因便于篩選含有目的基因的受體細(xì)胞，D正確。答案：A

[師說重難]

1．目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法類型方法說明特點(diǎn)植物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因插入農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的TDNA上→轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌→用農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞→將目的基因整合到植物細(xì)胞染色體的DNA上→目的基因表達(dá)經(jīng)濟(jì)、有效，適用于雙子葉植物和裸子植物，尤其適用于雙子葉植物花粉管通道法在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭→滴加DNA(含目的基因)，使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞→目的基因表達(dá)簡便、經(jīng)濟(jì)，我國科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)的一種方法動(dòng)物細(xì)胞顯微注射技術(shù)將含有目的基因的表達(dá)載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→注射了目的基因的受精卵，經(jīng)胚胎早期培養(yǎng)后，移植到雌性動(dòng)物的輸卵管或子宮內(nèi)→獲得具有新性狀的動(dòng)物將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞最為有效的方法微生物細(xì)胞Ca2＋處理法(感受態(tài)細(xì)胞法)用Ca2＋處理微生物細(xì)胞→感受態(tài)細(xì)胞→將基因表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合→在一定溫度下促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子簡便、經(jīng)濟(jì)、有效續(xù)表2．農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法分析(1)構(gòu)建攜帶目的基因的表達(dá)載體，需要兩種工具酶：限制酶和DNA連接酶。(2)基因表達(dá)載體(重組質(zhì)粒)導(dǎo)入農(nóng)桿菌細(xì)胞時(shí)，要用Ca2＋處理農(nóng)桿菌細(xì)胞，使其處于感受態(tài)，利于重組質(zhì)粒的導(dǎo)入。(3)由導(dǎo)入目的基因的受體細(xì)胞培育成完整的植株要用到植物組織培養(yǎng)技術(shù)。3．目的基因的檢測與鑒定的方法比較類型檢測內(nèi)容方法結(jié)果顯示分子水平檢測目的基因是否插入轉(zhuǎn)基因生物DNA上DNA分子雜交技術(shù)(DNA和DNA之間)是否成功顯示出雜交帶目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA分子雜交技術(shù)(DNA和mRNA之間)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗原－抗體雜交(蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)之間)個(gè)體生物學(xué)水平鑒定是否具有抗性及抗性程度對(duì)轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)行抗性的接種實(shí)驗(yàn)是否賦予了預(yù)期抗性或蛋白質(zhì)活性基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的功能活性是否相同比較基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的功能活性[特別提醒]

①探針是用放射性同位素等標(biāo)記的含目的基因的DNA片段。②DNA分子雜交和分子雜交(DNA和mRNA之間)的依據(jù)均是堿基互補(bǔ)配對(duì)原則。[在應(yīng)用中悟][典例1]下列關(guān)于目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的敘述，錯(cuò)誤的是 (

)A．培育“黃金大米”可用花粉管通道法導(dǎo)入目的基因B．顯微注射技術(shù)是將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞采用最多的方法C．目的基因?qū)氪竽c桿菌最常用的方法是Ca2＋處理法D．農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法是將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞最常用的方法[解析]水稻的花很小，不適合用花粉管通道法導(dǎo)入目的基因，A錯(cuò)誤；將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞常用顯微注射法，B正確；將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞最常用的方法是用Ca2＋處理大腸桿菌，使其處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的狀態(tài)，C正確；將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞最常用的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，此外還有基因槍法和花粉管通道法，D正確。[答案]

A[典例2]農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞后，能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA插入植物基因組中。圖示為利用農(nóng)桿菌培育轉(zhuǎn)基因植物的基本流程，請(qǐng)據(jù)圖回答：(1)剪除Ti質(zhì)粒的某些片段、替換復(fù)制原點(diǎn)O與添加抗生素的抗性基因T的過程①中，需用多種限制酶處理，原因是______________________________________，需用__________________“縫合”雙鏈DNA片段的平末端。(2)目的基因是指__________________。由過程②形成的基因表達(dá)載體中，目的基因的上游具有________，它是________________________識(shí)別和結(jié)合的部位。(3)過程③常用________處理使農(nóng)桿菌成為感受態(tài)細(xì)胞?？股乜剐曰騎的作用是__________________________________________________________________。(4)可通過________技術(shù)檢測試管苗的染色體DNA上是否插入了目的基因。[解析]

(1)Ti質(zhì)粒具多種限制酶切割位點(diǎn)，是因?yàn)椴煌南拗泼缸R(shí)別并切割不同的堿基序列。連接平末端應(yīng)選用T4DNA連接酶。(2)目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。目的基因的上游具有啟動(dòng)子，以便于RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合。(3)過程③常采用Ca2＋(CaCl2溶液)處理農(nóng)桿菌，以增大農(nóng)桿菌細(xì)胞壁的通透性?？股乜剐曰騎用于檢測受體細(xì)胞中是否含有基因表達(dá)載體。(4)檢測試管苗的染色體DNA中是否插入目的基因常采用PCR技術(shù)。[答案]

(1)不同的限制酶識(shí)別并切割不同的堿基序列T4DNA連接酶(2)編碼蛋白質(zhì)的基因啟動(dòng)子RNA聚合酶(3)Ca2＋(CaCl2溶液)用于鑒定和篩選導(dǎo)入了基因表達(dá)載體的農(nóng)桿菌(4)PCR[在訓(xùn)練中評(píng)]1．農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移并隨機(jī)插入到被侵染植物的染色體DNA中。研究者將下圖中被侵染植物的DNA片段連接成環(huán)，并以此環(huán)為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出T-DNA插入位置兩側(cè)的未知序列，據(jù)此可確定T-DNA插入的具體位置。下列有關(guān)說法，正確的是 (

)A．農(nóng)桿菌在自然條件下對(duì)大多數(shù)單子葉植物有感染能力B．利用圖中的引物②、③組合可擴(kuò)增出兩側(cè)的未知序列C．進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)需要有解旋酶和耐高溫的DNA聚合酶D．與受體細(xì)胞基因組序列比對(duì)可確定T-DNA的插入位置解析：農(nóng)桿菌在自然條件下對(duì)大多數(shù)雙子葉植物和裸子植物有感染能力，A錯(cuò)誤；DNA的兩條鏈反向平行，子鏈從引物的3′端開始延伸，則利用圖中的引物①、④組合可擴(kuò)增出兩側(cè)的未知序列，B錯(cuò)誤；進(jìn)行PCR擴(kuò)增需要耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶)，但不需要解旋酶，C錯(cuò)誤；通過與受體細(xì)胞的基因組序列比對(duì)，即可確定T-DNA的插入位置，D正確。答案：D

2．如圖為轉(zhuǎn)基因抗蟲煙草的培育流程，下列敘述正確的是 (

)A．培育過程①需要使用纖維素酶和果膠酶B．培育過程②將重組Ti質(zhì)粒導(dǎo)入煙草細(xì)胞前需要使用CaCO3處理農(nóng)桿菌C．培育過程③④僅通過調(diào)節(jié)生長調(diào)節(jié)劑可誘導(dǎo)愈傷組織再生出新植株D．可通過觀察害蟲吞食轉(zhuǎn)基因煙草后的存活情況進(jìn)行個(gè)體水平檢測解析：過程①表示基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程，即形成重組Ti質(zhì)粒的過程，需要使用限制酶和DNA連接酶，不需要纖維素酶和果膠酶，A錯(cuò)誤；過程②是將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的過程，在將重組Ti質(zhì)粒導(dǎo)入煙草細(xì)胞前需要先使用CaCl2處理農(nóng)桿菌，B錯(cuò)誤；過程③④為再分化形成植株的過程，該過程中需要通過調(diào)節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)和生長調(diào)節(jié)劑的配比，從而實(shí)現(xiàn)由愈傷組織誘導(dǎo)出芽和根的頂端分生組織的目的，并由此再生出新植株，C錯(cuò)誤；可通過進(jìn)行個(gè)體水平的檢測判斷轉(zhuǎn)基因抗蟲煙草是否培育成功，即讓害蟲吞食轉(zhuǎn)基因煙草，觀察害蟲的存活情況進(jìn)行判斷，D正確。答案：D

2．PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行嚴(yán)格滅菌，為什么？提示：避免污染使外源性DNA大量擴(kuò)增，造成假陽性反應(yīng)。3．將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，程序應(yīng)該怎樣設(shè)定？提示：4．本實(shí)驗(yàn)中DNA遷移速率主要與哪種因素有關(guān)？提示：在本實(shí)驗(yàn)中，主要考慮DNA分子的遷移速率與其大小成反比。5．判斷是否成功擴(kuò)增出DNA片段的依據(jù)是什么？如果沒有成功應(yīng)該從哪些方面分析？提示：一次成功的DNA片段擴(kuò)增應(yīng)該產(chǎn)生與預(yù)期大小一致的DNA片段。若出現(xiàn)與預(yù)期不一致的結(jié)果，可嘗試從以下幾個(gè)方面進(jìn)行分析：模板DNA的制備、引物的質(zhì)量與特異性、酶的質(zhì)量以及PCR循環(huán)的條件。6．如果沒有出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，可能的原因有哪些？提示：模板DNA含有蛋白或含有TaqDNA聚合酶的抑制劑(如蛋白酶K、苯酚、EDTA);TaqDNA聚合酶失活；引物出現(xiàn)質(zhì)量問題，濃度不合適；Mg2＋濃度過低；變性溫度低，變性時(shí)間短；目的序列變異等。[師說重難]

一、實(shí)驗(yàn)原理1．利用PCR可以在體外進(jìn)行DNA片段的擴(kuò)增。PCR利用了DNA的熱變性原理，通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合。PCR儀實(shí)質(zhì)上就是一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器。一次PCR一般要經(jīng)歷30次循環(huán)。2．PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)。凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來。二、實(shí)驗(yàn)操作步驟1．PCR擴(kuò)增DNA片段2．電泳法鑒定DNA片段三、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1．微量移液器不能超量程使用。使用一次性屏蔽式吸液槍頭有助于防止吸取的液體流入微量移液器，從而減少實(shí)驗(yàn)過程中的交叉污染。2．為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。3．為保證加入反應(yīng)體系中的各試劑體積的準(zhǔn)確性，要按照加入體積的大小，由大到小依次加入各試劑，即最先加入無菌水。為保護(hù)酶的活性，一般最后加入TaqDNA聚合酶。4．應(yīng)按照教材或試劑盒說明書建議的體積加入各試劑，隨意加大試劑用量并不會(huì)提高PCR擴(kuò)增的成功率。例如，高濃度的引物可能引發(fā)錯(cuò)配，導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增；高濃度的4種脫氧核苷酸可能對(duì)擴(kuò)增起抑制作用。5．該實(shí)驗(yàn)所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在－20℃儲(chǔ)存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。6．在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。7．在進(jìn)行操作時(shí)，一定要戴好一次性手套。8．配膠時(shí)，當(dāng)凝膠溶液冷卻到不燙手時(shí)可加入核酸染料，科學(xué)研究中最常用的是EB(溴化乙錠)。EB是一種熒光染料，有劇毒，具有高致癌性，可用其他靈敏度高、毒性低的新型核酸染料替代它，如Goldview。[在應(yīng)用中悟][典例1]下列關(guān)于PCR操作過程的敘述，錯(cuò)誤的是 (

)A．PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌B．PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在－20℃儲(chǔ)存C．PCR所用的緩沖液和酶從冰箱拿出之后，迅速融化D．在微量離心管中添加反應(yīng)成分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換[解析]在冰箱中放置的緩沖液和酶，取出后應(yīng)放在冰塊上緩慢融化，不能迅速融化。[答案]

C[典例2]

(2021·全國甲卷)PCR技術(shù)可用于臨床的病原菌檢測。為檢測病人是否感染了某種病原菌，醫(yī)生進(jìn)行了相關(guān)操作：①分析PCR擴(kuò)增結(jié)果；②從病人組織樣本中提取DNA；③利用PCR擴(kuò)增DNA片段；④采集病人組織樣本?；卮鹣铝袉栴}：(1)若要得到正確的檢測結(jié)果，正確的操作順序應(yīng)該是__________(用數(shù)字序號(hào)表示)。(2)操作③中使用的酶是__________。PCR反應(yīng)中的每次循環(huán)可分為變性、復(fù)性、__________三步，其中復(fù)性的結(jié)果是_________________________________。(3)為了做出正確的診斷，PCR反應(yīng)所用的引物應(yīng)該能___________特異性結(jié)合。(4)PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)是指____________________________________。該技術(shù)目前被廣泛地應(yīng)用于疾病診斷等方面。[解析]

(1)PCR技術(shù)可用于臨床的病原菌檢測，若要得到正確的檢測結(jié)果，正確的操作順序應(yīng)該是④采集病人組織樣本→②從病人組織樣本中提取DNA→③利用PCR擴(kuò)增DNA片段→①分析PCR擴(kuò)增結(jié)果。(2)在用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA時(shí)，DNA的復(fù)制過程與細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制類似，操作③中使用的酶是Taq酶(熱穩(wěn)定DNA聚合酶)，PCR反應(yīng)中的每次循環(huán)可分為變性、復(fù)性、延伸三步，其中復(fù)性的結(jié)果是Taq酶從引物起始進(jìn)行互補(bǔ)鏈的合成。(3)DNA復(fù)制需要引物，為了做出正確的診斷，PCR反應(yīng)所用的引物應(yīng)該能與兩條單鏈DNA特異性結(jié)合。(4)PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。該技術(shù)目前被廣泛地應(yīng)用于疾病診斷等方面。[答案]

(1)④②③①

(2)Taq酶(熱穩(wěn)定DNA聚合酶)延伸Taq酶從引物起始進(jìn)行互補(bǔ)鏈的合成(3)兩條單鏈DNA

(4)一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)[在訓(xùn)練中評(píng)]1．PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定的DNA片段的核酸合成技術(shù)，下圖表示合成過程。下列說法錯(cuò)誤的是 (

)A．a(chǎn)過程高溫使DNA變性解旋，該過程不需要解旋酶的作用B．c過程要用到的酶在高溫下失活，因此在PCR擴(kuò)增時(shí)需要再添加C．如果把模板DNA的兩條鏈用15N標(biāo)記，游離的脫氧核苷酸不標(biāo)記，控制“94℃～55℃～72℃”溫度循環(huán)3次，則在形成的子代DNA中含有15N標(biāo)記的DNA占25%D．PCR中由堿基錯(cuò)配引起的變異屬于基因突變解析：PCR中解旋是通過高溫進(jìn)行的，該過程不需要解旋酶的作用，A正確；c過程用到的酶為耐高溫的DNA聚合酶，在高溫下不會(huì)失活，因此在PCR擴(kuò)增時(shí)不需要再添加，B錯(cuò)誤；如果把模板DNA的兩條鏈用15N標(biāo)記，游離的脫氧核苷酸不做標(biāo)記，循環(huán)3次后，形成的DNA分子為8個(gè)，而含有15N標(biāo)記的DNA分子為2個(gè)，故在形成的子代DNA中含有15N標(biāo)記的DNA占25%，C正確；PCR中由堿基錯(cuò)配引起的變異屬于基因突變，D正確。答案：B

2．下列有關(guān)電泳的敘述，錯(cuò)誤的是 (

)A．電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程B．待測樣品中各種分子的形狀、大小及帶電性質(zhì)的差異等會(huì)影響其在電泳中的遷移速度C．進(jìn)行電泳時(shí)，帶電粒子會(huì)向著與其所帶電荷相同的電極移動(dòng)D．常用的電泳方法是瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳解析：電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程，A正確；待測樣品中各種分子的形狀、大小及帶電性質(zhì)的差異等會(huì)影響其在電泳中的遷移速度，B正確；進(jìn)行電泳時(shí)，帶電粒子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)，C錯(cuò)誤；常用的電泳方法是瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳，D正確。答案：C

科學(xué)思維——?dú)w納比較目的基因的檢測與鑒定方法1．目的基因檢測與鑒定方法的比較續(xù)表場所不論是復(fù)制水平、轉(zhuǎn)錄水平還是翻譯水平上的檢測，都是在體外進(jìn)行的原理進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的檢測原理與復(fù)制水平的檢測原理是相似的，都遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，只是被檢測的物質(zhì)不再是轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA，而是轉(zhuǎn)基因生物細(xì)胞內(nèi)的mRNA；進(jìn)行翻譯水平的檢測，則是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理