專業(yè)：_口腔醫(yī)學(xué)專業(yè)：_口腔醫(yī)學(xué)_______姓名：__王雪婷________學(xué)號(hào)：__3130102930____日期：__2015.6.1______地點(diǎn)：___醫(yī)教A401_____課程名稱：_病原生物學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)_____指導(dǎo)老師：__王迪__________成績(jī)：___________實(shí)驗(yàn)名稱：沉淀反應(yīng)、補(bǔ)體參與的免疫反應(yīng)_實(shí)驗(yàn)類型：_操作型_同組學(xué)生姓名：吳文治___沉淀反應(yīng)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?、熟知沉淀反應(yīng)的概念和分類2、領(lǐng)會(huì)雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和對(duì)流免疫電泳試驗(yàn)的結(jié)果判斷3、學(xué)會(huì)沉淀反應(yīng)在臨床檢驗(yàn)及科研中的應(yīng)用一、雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)【實(shí)驗(yàn)原理】利用可溶性抗原與相應(yīng)抗體在半固體瓊脂內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)散，當(dāng)兩者比例合適時(shí)，就出現(xiàn)白色沉淀線，此方法稱為瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)?？煞譃閱蜗颦傊瑪U(kuò)散試驗(yàn)和雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)。物質(zhì)自由運(yùn)動(dòng)形成擴(kuò)散現(xiàn)象，擴(kuò)散可以在各種介質(zhì)中進(jìn)行。我們所使用的1％～2%的瓊脂凝膠，瓊脂形成網(wǎng)狀構(gòu)架，空隙中是98％～99%的水，擴(kuò)散就在此水中進(jìn)行。允許分子量在20萬(wàn)以下甚至更大些的大分子物質(zhì)通過(guò)，絕大多數(shù)可溶性抗原和抗體的分子量在20萬(wàn)以下，因此可以在瓊脂凝膠中自由擴(kuò)散，所受阻力甚小。二者在瓊脂凝膠中相遇，在最適比例處發(fā)生沉淀，此沉淀物因顆粒較大而不擴(kuò)散，故形成沉淀帶。雙向擴(kuò)散試驗(yàn)是將抗原和抗體加入同一凝膠中兩個(gè)相隔一定間距的小孔內(nèi)，使兩者進(jìn)行相互擴(kuò)散。當(dāng)抗原和抗體濃度之比相適宜時(shí)，彼此相遇形成一白色的沉淀線。臨床上用此法檢測(cè)患者血清中的甲胎球蛋白（AFP），作為原發(fā)性肝癌的重要診斷指標(biāo)?！緦?shí)驗(yàn)材料】抗體：抗AFP抗原:AFP待測(cè)血清?！?％瓊脂玻片、吸管、微量加樣器、打孔器、水浴箱、濕盒、溫箱?！緦?shí)驗(yàn)方法】將瓊脂加熱熔化，冷卻至50－60度，用吸管吸取4ml緩緩加在玻片上（滴加時(shí)要小心，要使瓊脂蓋滿玻片，勿溢出并避免產(chǎn)生氣泡）待瓊脂凝固后，用打孔器打孔。用微量加樣器加樣，向三角孔隨意一孔內(nèi)加抗體，其余兩孔分別加正常人血清、待檢血清，做好標(biāo)記。如下圖？標(biāo)本AgAb？標(biāo)本AgAb將加樣的瓊脂凝膠板平放于濕盒內(nèi)，置37℃，24h后觀察結(jié)果?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】本組的結(jié)果：現(xiàn)象不明顯。陽(yáng)性對(duì)照的白色沉淀線也無(wú)法觀察到。其他組結(jié)果：兩條白色的沉淀線，說(shuō)明待測(cè)血清中含有甲胎球蛋白，該患者患有原發(fā)性肝癌?！緦?shí)驗(yàn)分析】本組的實(shí)驗(yàn)沒(méi)有現(xiàn)象，陽(yáng)性對(duì)照的白色沉淀線也無(wú)法觀察到，可能原因是：在用微量移液器向各孔加入相應(yīng)試劑之前沒(méi)有將試劑振蕩均勻，吸出的試劑中蛋白質(zhì)含量少。瓊脂凝膠變形程度較大，影響折光性，肉眼不便觀察。我們組的凝膠凝固較緩慢，不夠成型，這樣會(huì)對(duì)抗原抗體在凝膠中的擴(kuò)散產(chǎn)生影響，或者抗體與抗原結(jié)合后的復(fù)合體在凝膠中無(wú)法形成沉淀線。二、免疫電泳試驗(yàn)【實(shí)驗(yàn)原理】當(dāng)抗原和抗體在瓊脂介質(zhì)中電泳時(shí)，抗體的PI比較高，在適當(dāng)?shù)膒H值下，抗體帶正電荷而抗原帶負(fù)電荷，故在電場(chǎng)中抗體向陰極方向移動(dòng)而抗原向陽(yáng)極運(yùn)動(dòng)，直至相遇后形成沉淀線，其原理與雙向免疫擴(kuò)散相同，但具有方法簡(jiǎn)便，快速及一次電泳可以檢測(cè)多個(gè)樣品等特點(diǎn)【實(shí)驗(yàn)材料】電泳緩沖液：pH8.6巴比妥-鹽酸緩沖液?？贵w：抗AFP。抗原：AFP陽(yáng)性血清、待檢病人血清。1％瓊脂用pH8.6巴比妥-鹽酸緩沖液配制，冰箱保存?zhèn)溆谩ｋ娪緝x、電泳槽、載玻片、打孔器、10ml吸管、移液器、移液頭?！緦?shí)驗(yàn)方法】制板打孔(已事先準(zhǔn)備好)加樣。將抗原加入瓊脂板上有標(biāo)記孔側(cè)的小孔中，抗體加入另一側(cè)小孔中，以加滿為度，不可溢出孔外。(如圖示)Mark，標(biāo)記孔作負(fù)極AgAgAbAbMark，標(biāo)記孔作負(fù)極AgAgAbAbAgAgAbAgAgAb抗AFPAFP陽(yáng)性血清待測(cè)病人血清電泳。將加好樣品的瓊脂板置電泳槽上，抗原側(cè)置陰極端，抗體孔側(cè)置陽(yáng)極端。搭好橋后，接通電源，控制電壓6－10V/cm板長(zhǎng)，電泳約30－60min。關(guān)閉電源，取出瓊脂板，觀察結(jié)果?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】出現(xiàn)了兩條白色沉淀線，說(shuō)明待測(cè)血清呈陽(yáng)性，含有AFP，病患為原發(fā)性肝癌?！緦?shí)驗(yàn)討論及注意事項(xiàng)】電泳時(shí)電流不宜過(guò)大，以免蛋白變性?？乖涂贵w的電極方向不能搞錯(cuò)。電泳所需時(shí)間與孔間距離有關(guān)，距離越大，電泳時(shí)間越長(zhǎng)?？乖贵w的濃度要適當(dāng)，抗原太濃或太稀都不易出現(xiàn)沉淀線。補(bǔ)體參與的免疫反應(yīng)之溶血反應(yīng)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹渴熘a(bǔ)體“滅能”的概念。領(lǐng)會(huì)補(bǔ)體在溶血反應(yīng)中的作用。學(xué)會(huì)補(bǔ)體參與的免疫反應(yīng)在臨床檢驗(yàn)和科研中的實(shí)際應(yīng)用。【實(shí)驗(yàn)原理】溶血反應(yīng)是補(bǔ)體參與的抗體致敏紅細(xì)胞的溶解反應(yīng)。參與反應(yīng)的成分有3種：①紅細(xì)胞，一般用綿羊紅細(xì)胞（SRBC）；②抗紅細(xì)胞抗體，也稱溶血素，多為家兔抗SRBC的抗血清；③補(bǔ)體。溶血反應(yīng)的直接用途是測(cè)定總補(bǔ)體活性或溶血素的效價(jià)；也可利用溶血系統(tǒng)作為指示劑，檢測(cè)另一反應(yīng)系統(tǒng)的抗原或抗體，即補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)?！緦?shí)驗(yàn)材料】1、2％綿羊紅細(xì)胞、溶血素、補(bǔ)體、生理鹽水2、小試管、吸管、滴管【實(shí)驗(yàn)方法】取小試管，按下表加入試劑將上述試管放置于37度水浴15－30分鐘，觀察有無(wú)溶血現(xiàn)象。將不溶血試管（第2、3管）低速離心3－5分鐘，使紅細(xì)胞沉淀。將第2管上清液倒入第4管，將第3管上清液倒入第5管，然后再按下表加入試劑?；靹蚝?，將上述試管放置于37度水浴15－30分鐘，觀察有無(wú)溶血現(xiàn)象?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】3號(hào)管，溶液懸濁，無(wú)溶血現(xiàn)象23號(hào)管，溶液懸濁，無(wú)溶血現(xiàn)象2號(hào)管，溶液懸濁，無(wú)溶血現(xiàn)象1號(hào)管，溶液透明，有溶血現(xiàn)象第一次水浴放置后5號(hào)管，溶液紅色澄清透明，有溶血現(xiàn)象4號(hào)管，溶液紅色懸濁5號(hào)管，溶液紅色澄清透明，有溶血現(xiàn)象4號(hào)管，溶液紅色懸濁，無(wú)溶血現(xiàn)象3號(hào)管，溶液紅色懸濁，無(wú)溶血現(xiàn)象2號(hào)管，溶液無(wú)色透明，試管底有紅色沉淀物。第二次水浴放置之后最終結(jié)果：第1、5管出現(xiàn)溶血，第3、4兩管均不溶血。而第2管溶液無(wú)色透明，試管底有紅色沉淀物，無(wú)法觀察到溶血現(xiàn)象，與理論結(jié)果不同，是由于在操作將第2管上清液倒入第4管后再加相應(yīng)試劑后未將2號(hào)管中的沉淀物質(zhì)打散使抗原抗體復(fù)合物無(wú)法與加