肝病蛋白質(zhì)組學研究

劉殿武河北醫(yī)科大學公衛(wèi)學院2014.6蛋白質(zhì)組學是干什么的？蛋白質(zhì)組學研究解決什么問題？黑猩猩與人染色體差異1.23%(Science,2002)差異否？蛋白質(zhì)組學是干什么的？研究不同物種間差異研究同種具有不同特征物種間差異研究物種進化不同階段的差異

物種間蛋白質(zhì)差異IntroductionApplicationResearchexample123Introduction隨著基因組研究的進一步深入，人們越來越清晰地知道了人類的全部遺傳密碼即基因組序列，這是否意味著人類可以任意控制人的生老病死呢？人類基因組計劃(humangenomeproject,HGP)是由美國科學家于1985年率先提出，于1990年正式啟動的。美國、英國、法蘭西共和國、德國、日本和我國科學家共同參與了這一預算達30億美元的人類基因組計劃。2001年得到人類基因組序列的"草稿"，2003年得到最后"定稿"

人類基因組計劃DNAmRNAProteinsCellfunctionsProteome“Proteomics”Genome“Genomics”什么是蛋白質(zhì)？蛋白質(zhì)是一種復雜的有機生物大分子，它們是生命活動的實際執(zhí)行者。蛋白質(zhì)由一個一個的氨基酸首尾相接形成肽鏈，肽鏈再折疊形成一定空間結(jié)構。

什么是蛋白質(zhì)？？什么是蛋白質(zhì)組？

蛋白質(zhì)組“proteome”一詞源于“PROTEin”與“genOME”的雜合。是指“由一個基因組、一種生物或一個細胞/組織的基因組所表達的全套蛋白質(zhì)”。熒光染色的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)蛋白組學的研究方法

分離技術鑒定技術功能研究Introduction

樣品制備技術

一、樣品制備技術蛋白樣品制備的一般要求1.應使所有待分析蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)，且制備方法應具有重現(xiàn)性。2.保證樣品在電泳過程中保持溶解狀態(tài)，避免溶解性低的蛋白質(zhì)在等點聚焦時由于溶解度降低而沉淀析出。3.排除多糖、核酸、脂類其他干擾分子；同時避免處理環(huán)境對蛋白質(zhì)的污染。4.防止樣品處理過程中發(fā)生蛋白質(zhì)的化學修飾，包括蛋白質(zhì)降解、蛋白酶或尿素熱分解后引起的修飾；5.盡量去除起干擾作用的高峰度或無關蛋白，保證待研究蛋白在可檢測水平6.盡可能縮短樣品的處理時間，盡可能在低溫環(huán)境中處理。常用的處理方法1.細胞的洗滌2.細胞的破碎裂解3.除去污染物4.微透析5.電泳脫鹽6.蛋白沉淀

1.細胞的洗滌

目的：去除污染物常用的緩沖液：PBS注意：保持適當?shù)臐B透壓，避免細胞溶解。2.細胞的破碎裂解

不同的生物體或同一生物體的不同部位的組織，其細胞破碎的難易不一，使用的方法也不相同，如動物臟器的細胞膜較脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有堅固的纖維素、半纖維素組成的細胞壁，要采取專門的破碎方法。各種細胞破碎方法的應用范圍3.除去污染物

DNA/RNA脂類污染物的種類鹽固體雜質(zhì)4.微透析

常用于小體積樣品膜的截留分子量8000Da5.蛋白沉淀

目的：低濃度蛋白可以得到濃縮；有時可以去除某些干擾物質(zhì)；抑制蛋白酶活性；方法：硫酸銨沉淀法；三氯乙酸沉淀法；丙酮沉淀法；丙酮/三氯乙酸沉淀法；二、分離技術：1.Two-dimensionalProteinElectrophoresis(2DE)分離技術2.熒光差異顯示雙向電泳（Fluorescence2Ddifferentialgelelectrophoresis，F(xiàn)-2DDIGE）這是一種定量分析凝膠上蛋白質(zhì)點的新方法.它是將待比較的兩種樣品提取的總蛋白質(zhì)分別與兩種不同的熒光標記試劑（Cy2、Cy3或Cy5）進行共價標記，然后將不同熒光染料標記的兩種待比較的蛋白質(zhì)樣品等量混合，上樣進行雙向電泳，2D凝膠在成像儀上用兩種不同波長激發(fā)，并將兩種樣品的熒光圖譜顯示成像，用2D分析軟件進行定量分析。將定量上顯示有明顯差異的蛋白質(zhì)點切下后進行鑒定分析，從而確定差異表達的蛋白質(zhì)。三、鑒定技術1.質(zhì)譜技術2.同位素親和標簽（isotope-codedaffinitytags,ICAT）

一種定量研究蛋白質(zhì)表達譜的新方法。ICAT是一種人工合成的化學試劑。ICAT反應基團與蛋白質(zhì)的Cys殘基共價結(jié)合，充分反應后，將兩種標記后的蛋白等量混合，再用胰蛋白酶解。經(jīng)抗生物素的親和層析純化后，含生物素的ICAT酶解片段可以進行在線HPLC-MS/MS分析。IntroductionApplicationResearchexample123應用價值1.癌癥目前用到的腫瘤標志物，從19世紀鑒定的骨髓瘤的本周氏蛋白到上皮癌細胞系腫瘤特異性抗體都是基于蛋白組學的方法得到的。對于與癌有關的蛋白來說，用多種抗體可以使我們了解該通路中的蛋白特征，例如，一些癌基因產(chǎn)物或細胞周期蛋白的過表達或者是翻譯后修飾可以在轉(zhuǎn)化的肝細胞中檢測到.

2.感染性疾病近年來，除結(jié)核、多重耐藥鏈球菌感染及機會致病菌外，出現(xiàn)了一些新的感染因素如HIV、埃博拉病毒等。因此這些致病微生物的蛋白質(zhì)組分析，對于了解其毒性因子、抗原及疫苗的制備非常重要，此外對疾病的診斷、治療和預防也同樣重要。

3.其他疾病

如擴張型心臟疾病，目前其發(fā)病機理不明，推測可能為多種因素所致。Knecht等采用2-DE取得了3300個心肌蛋白條帶，通過氨基酸序列分析、Edman降解法及基質(zhì)輔助的激光解吸離子化質(zhì)譜（MALDI-MS）等分析了其中150條。經(jīng)活檢及術后病理證實，有12條為擴張性心肌病特有的蛋白。但具體資料尚在進一步分析之中。ApplicationinDiagnosis應用SELDI-TOF-MS技術對乳頭吸液（nippleaspiratefluid,NAF）標本進行蛋白質(zhì)組學分析，結(jié)果顯示，在乳腺癌和正常乳腺的NAF中有5種差異表達蛋白質(zhì)，其中6.5kD和15.9kD的蛋白質(zhì)敏感性和特異性最好，在乳腺癌患者中陽性率為25%-84%，而在正常人中陽性率為0-9%。將NAF的蛋白質(zhì)組學分析與乳腺X線攝影和物理檢查結(jié)合可提高乳腺癌的早期診斷率。ApplicationinDiagnosisSELDI-TOF-MS分析82例肝硬化患者(其中38例不伴有HCC,44例為HCC)血清,鑒定了一種分子量為8900D的蛋白在HCC組織表達上調(diào),此蛋白峰的強度與腫瘤的大小成正比。體外實驗證實,此蛋白為玻連蛋白的羧基末端,在HCC表達增高,可反映HCC的侵襲性。因此,玻連蛋白的羧基末端多肽可望成為HCC新的血清標記物。利用血清蛋白質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)了能夠提高結(jié)核診斷率的標志物ApplicationinDiagnosisApplicationinmechanism通過對HIV陽性患者及正常人外周血單核細胞差異性蛋白分析，得到黏著斑蛋白、裸蛋白等潛在標志物，促進了對HIV潛在機制的研究。ApplicationinTreatment

白血?。?/p>

白血病是血液系統(tǒng)的常見惡性腫瘤，臨床上分型較多，而不同的亞型之間，所用的治療方案不同，其預后結(jié)果也不相同，所以白血病的分型顯得尤為重要。

為了明確急性白血病FAB分型中所涉及的關鍵蛋白，對61例急性白血病患者進行篩查，發(fā)現(xiàn)髓系相關蛋白8和14僅在M2和M3型中高表達。因此，這兩種標志物蛋白可以作為急性髓系白血病（AML）分型標志蛋白，有利于選擇正確的治療方案。ApplicationinTreatment

直腸癌：

蛋白質(zhì)組學技術可用于直腸癌手術前分子分期，對判斷結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移有重要意義。徐文鴻等應用SELDI-TOF-MS，分析了76例結(jié)直腸癌患者的血清標本，建立并驗證了分期模型。通過SELDI-TOF-MS技術所篩選的候選腫瘤標志物可以指導大腸癌的綜合治療，所建立的診斷模型可以輔助臨床明確大腸癌的術前分期。網(wǎng)上蛋白質(zhì)組學資源

蛋白質(zhì)組研究技術、信息等。

從新藥開發(fā)角度，發(fā)現(xiàn)新蛋白及新作用。

可以找到蛋白質(zhì)組研究相關企業(yè)、各種儀器來源、新聞等。

teome.co.uk各種蛋白質(zhì)組研究相關信息

http://www.micromass.co.uk介紹蛋白質(zhì)鑒定的先進儀器

.au蛋白質(zhì)鑒定專家系統(tǒng)，AustralianProteomeAnalysisFacility

http://expasy.cbr.nrc.ca蛋白質(zhì)鑒定專家系統(tǒng)，CanadianBioinformaticsResourceIntroductionApplicationResearchexample123

InvestigationandIdentificationofdisease-relatedpeptideinserafrompatientswithchronichepatitisB

慢性乙肝相關肝病差異蛋白的查找選擇研究的疾病本研究：選擇急慢性乙肝、肝硬化和肝癌。獲取樣品血清樣品質(zhì)量很重要：采血前要確認病人是否空腹采血和盛放血液裝置無無機物、無任何抗凝或血沉物質(zhì)等干擾實驗。防止溶血、乳靡、絮狀沉淀等血清樣本在采血后3小時內(nèi)處理并冷凍。血清分裝后，-80℃儲藏。-20℃存放時間太長影響實驗結(jié)果。液體芯片分離蛋白ClinProtBeadsClinProtBeadsClinProtBeads疏水型MB-HIC1

MB-HIC3MB-HIC8

MB-HIC18弱陽離子弱陰離子MB-WCX

MB-WAX金屬離子MB-IMAC-Fe

MB-IMAC-Cu質(zhì)譜分析Clinprotools軟件分析VisualcomparisonStatisticalinformationBestseparatingpeaksacc.T-testDiseasedHealthy差異蛋白發(fā)現(xiàn)疾病診斷模型建立和診斷CHBgroupAHB

group49distinguishedprotein急性乙型肝炎和慢性乙肝炎患者血清蛋白質(zhì)組的比較差異最明顯的前10位蛋白進行分組效率計算4154Da4210Da聯(lián)合應用診斷急性乙肝靈敏度、特異度、驗證正確率分別達到100%、84.21%、86.67%4210Da蛋白圖.MALDI-TOF質(zhì)譜分析得到的

4210Da圖像.

(A)四組病人4210Da蛋白的堆積圖，ClinProtTools?2.1軟件分析。(B)四組病人中4210Da的平均相對強度，ClinProtTools?2.1軟件分析

紅色：急性肝炎

綠色：慢性肝炎

藍色：肝硬化

黃色：肝癌

(C)SPSS15.0軟件分析。4210Da蛋白急性乙肝病人血清蛋白質(zhì)組的追蹤觀察B、G兩位病人轉(zhuǎn)為慢性A、E兩位病人痊愈追蹤觀察AHB患者，有4例達到觀察終點慢性乙肝輕、中、重型患者血清蛋白質(zhì)組的比較共發(fā)現(xiàn)29個差異蛋白慢性重型慢性中型慢性輕型無差異，合并VS靈敏度、特異度、驗證正確率分別達到100%、88.89%、93.42%1866Da單獨應用診斷慢性乙肝重型差異最明顯的前10位蛋白進行分組效率計算1866Da蛋白圖1.不同程度慢性肝炎病人的分布。(A)輕度(×)和中度(○)重疊比較多，可以聯(lián)合到一組。(B)聯(lián)合組(×)和重度組(□)可以明顯的區(qū)分開。1866Da蛋白在合并組和重型組具有明顯差異重型合并慢性乙肝（CHB）、肝硬化（LC）、肝癌（HCC）患者血清蛋白質(zhì)組的比較分析

CHB組

HCC組9個差異蛋白對9個差異蛋白進行分組效率計算11243Da4210Da聯(lián)合應用診斷HCC靈敏度、特異度、驗證正確率分別達到92.86%、77.63%、80.00%從CHB患者中間查找HCC患者更具臨床意義當CHB進展到LC階段時，其病理改變和嚴重性均已與HCC非常接近LC組

HCC組1個差異蛋白（2093Da）根據(jù)氨基酸序列，4210Da蛋白被鑒定為“Gene_Symbol=GSPT2EukaryoticpeptidechainreleasefactorGTP-bindingsubunitERF.4210蛋白氨基酸序列鑒定結(jié)果（36肽）1866Da蛋白經(jīng)檢索鑒定為補體3的一個片段

4210Da多肽功能研究eRF3b/GSPT2診斷價值的研究血液提取RNA熒光定量檢測GSPT2的相對表達量Fig.1TheexpressionofGSPT2/18sRNAinbloodofHBV-relateddiseasesTable2TheexpressionofGSPT2/18sRNAinbloodofnormalcontrolandHBVrelateddiseasesFig.2Receiver–operatorcurvesofbloodGSPT2indifferentiatingLC(left)and/orHCC(right)fromCHBgroup.TheareaunderthecurveforGSPT2is0.738(left)and0.751(right).Theop