新型酮康唑緩釋噴膜的制備及藥效學研究

濕疹、皮炎和皮膚癬是皮膚科常見病。部隊基層官兵由于特殊的作訓環(huán)境,這兩類疾病發(fā)病率高達60%左右。目前用于防治這兩類疾病的藥物劑型主要有軟膏劑、洗劑、溶液劑等,各劑型作用相對單一。本研究采用殼聚糖鹽酸鹽為成膜輔料,研制一種集抗真菌、抗炎、抗過敏一體的長效緩釋噴膜,對其質量控制進行了研究,并觀察其對豚鼠濕疹和體癬模型的療效。1材料表面1.1儀器、試藥Waters高效液相色譜儀:Waters600色譜泵,Waters996PDA紫外檢測器,Millennium32色譜工作站(梅特勒-托利多公司);超聲振蕩機(上海科學儀器廠);超濾儀(上?？茖W儀器廠);電子分析天平(梅特勒-托利多公司);梅特勒320pH計(梅特勒-托利多公司)。酮康唑(地奧集團成都藥業(yè)股份有限公司,批號:030902);醋酸地塞米松(天津天藥藥業(yè)股份有限公司,批號:DAG030801);殼聚糖鹽酸鹽(上海其勝生物材料技術研究所,平均相對分子質量100000,批號:030308);吐溫-80、水溶性硅油、乙醇等均符合藥用標準。酮康唑對照品、醋酸地塞米松對照品(中國藥品生物制品檢定所);自制酮康唑噴膜(批號:030818,030822,030824)。磷酸二氫鉀和氫氧化鈉(上海試劑四廠,分析純)、甲醇(上海復旦化學品廠永華試劑分廠,色譜純)。1.2性別、體復雜模型4~5周齡健康豚鼠55只,由第二軍醫(yī)大學實驗動物中心提供,合格證號:SYXK-(軍)2002-044。其中用于濕疹模型25只,均為雌性,體質量(232.4±33.0)g;用于體癬模型20只,雌雄各半,體質量(212.4±18.7)g;用于皮膚刺激性實驗10只,雌雄各半,體質量(218.6±16.2)g。2方法和結果2.1新型酮康唑噴膜的制備2.1.1殼聚糖鹽酸鹽的制備酮康唑10g,醋酸地塞米松0.5g,殼聚糖鹽酸鹽10g,吐溫-8010g,水溶性硅油10g,60%乙醇加至1000ml。2.1.2乙醇溶液的配制取處方量的殼聚糖鹽酸鹽加適量純化水脹溶,取處方量酮康唑、醋酸地塞米松加乙醇溶解,再加入吐溫-80,將上述醇溶液緩慢加入水溶液中。最后加水溶性硅油,攪勻,分裝于60ml噴瓶,密閉,即得。2.2新醇康唑噴膜的質量標準2.2.1斷裂本品為無色黏稠液體,有乙醇味。2.2.2紅色沉淀的制備酮康唑鑒別:取樣品1ml,加0.1mol/L鹽酸溶液10ml,在水浴上加熱溶解,放冷,濾過,濾液加碘化鉍鉀試液數滴,即生成橙紅色沉淀。醋酸地塞米松鑒別:取樣品10ml,置燒杯中,加無水乙醇50ml,在水浴上加熱溶解,放冷,濾過,濾液加堿性酒石酸銅試液1ml,即生成紅色沉淀。3批樣品鑒別均呈陽性反應。2.2.3玻璃板上干燥應符合《中國藥典(2000年版)》二部有關膜劑的一般規(guī)定,將本品涂于干凈玻璃板上,應在10min內干燥成膜,膜應有一定抗撕裂強度,微生物限度檢查應符合規(guī)定。3批樣品均符合相關要求。2.3新醇康唑噴膜含量的測定和方法學的研究2.3.1對照品溶液5.2%精密稱取酮康唑和醋酸地塞米松對照品適量,加乙醇分別配制酮康唑對照品溶液(1mg/ml)和醋酸地塞米松對照品溶液(1mg/ml)。另按2.1.1項下配制新型酮康唑噴膜樣品和空白噴膜基質,分別精密量取上述噴膜4.0ml,置50ml容量瓶中,加乙醇適量,超聲振蕩10min,加乙醇至刻度,搖勻,用微孔濾膜濾過,配制酮康唑噴膜測定液和空白噴膜測定液。2.3.2流動相、色譜相色譜柱WatersSymttryC18(250mm×4.6mm,5μm);流動相:甲醇-磷酸二氫鉀緩沖液(4∶1),pH7.4;檢測波長:239nm;流速:0.6ml/min;柱溫:(22±2)℃;進樣量:20μl。色譜圖見圖1。輔料不干擾樣品中主藥酮康唑和醋酸地塞米松的含量的測定。2.3.3標準曲線的建立精密稱取酮康唑和醋酸地塞米松對照品溶液適量,加乙醇稀釋成酮康唑濃度為0.2、0.4、0.8、1.6和2.0mg/ml和醋酸地塞米松濃度為0.02、0.04、0.08、0.16和0.20mg/ml的標準溶液,進樣按2.3.2項下條件。以峰面積(A)對濃度(c)求回歸方程,酮康唑:A1=(5.984×105)+(3.063×107)c1,r1=0.9997;醋酸地塞米松:A2=(1.947×104)+(4.123×107)c2,r2=0.9998。酮康唑和醋酸地塞米松的線性范圍分別為0.2~2.0mg/ml和0.02~0.20mg/ml。2.3.4平均回收率的測定精密量取樣品4.0ml,置50ml容量瓶中,精密加入酮康唑和醋酸地塞米松對照品溶液適量,加乙醇超聲處理10min,照2.3.6項下操作,每個濃度重復測定3次。計算酮康唑和醋酸地塞米松的回收率。酮康唑的平均回收率為98.41%,RSD=2.29%(n=6);醋酸地塞米松的平均回收率為97.84%,RSD=2.60%(n=6)。2.3.5測定多次感官測量方法精密量取樣品4.0ml,按2.3.6項下處理,每日測定3次,連續(xù)測定3d。計算酮康唑和醋酸地塞米松的日內RSD、日間RSD。兩者日內RSD及日間RSD分別為1.17%和1.26%、1.57%和1.40%(n=9)。2.3.6外標法計算樣品中酮康唑和醋酸地塞米松的含量按2.3.1項下方法制備樣品測定液,按2.3.2項下測定3批樣品,按外標法計算樣品中酮康唑和醋酸地塞米松的含量,分別為標示量的96.52%~97.26%和95.90%~97.26%。2.3.7肌肉注射和噴灑膜處理豚鼠10只,分為完整皮膚組(n=5)和破損皮膚組(n=5),豚鼠雙側背部剃毛4cm×6cm,破損組用砂紙摩擦皮膚至不滲血為度,將新型酮康唑噴膜涂抹于2組豚鼠左側背部,噴膜基質涂抹于右側。用紗布膠布固定,24h揭膜并用溫水洗凈殘留噴膜,分別于1、24、48、72h觀察豚鼠背部有無紅斑、水皰。結果顯示,揭膜1h豚鼠背部紅斑,24h完全消退,無水皰糜爛等表現,新型酮康唑噴膜和噴膜基質對豚鼠皮膚均無刺激性。2.4動物療效觀察2.4.1激發(fā)豬皮膚變性制備吸濕模型參照Fukuda等方法,以OVA為抗原激發(fā)豚鼠皮膚變態(tài)反應制備濕疹模型。采用穿刺法,豚鼠背部接種須癬毛癬菌(2×105CFU/ml)制備體癬模型。2.4.2體蚤模型檢測濕疹模型100個,分為A、B、C、D4組(n=25)。A組給新型酮康唑噴膜,1次/2d;B組給噴膜基質,1次/2d;C組給地塞米松止癢霜(0.05%),2次/d;D組不給藥。體癬模型20個,分為A、B、C、D4組(n=5)。A組給新型酮康唑噴膜,1次/2d;B組給噴膜基質,1次/2d;C組給復方酮康唑霜,2次/d;D組不給藥。2.4.3體髂性評分濕疹模型激發(fā)48h、治療1周分別對紅斑(0~4分)、水腫(0~2分)、抓痕(0~1分)進行評分。體癬癥狀評分:接種第11天和治療2周分別對丘疹(0~4分)、水皰(0~2分)、鱗屑(0~1分)進行評分;治療前涂片培養(yǎng)測陽性率;停藥2周涂片培養(yǎng)測陰性率。2.4.4地塞米松嘴唇多次給予對根據用藥前后皮損評分比較,進行療效判斷。治愈:用藥后皮損消退≥90%;顯效:皮損消退≥70%;有效:皮損消退≥30%;無效:皮損消退<30%。結果顯示,對于濕疹和體癬模型,新型酮康唑噴膜治療組效果分別與地塞米松止癢霜和復方酮康唑霜組一致,明顯優(yōu)于基質治療組和空白對照組(P<0.01,多樣本率的χ2檢驗,表1)。治療前A~D各組真菌培養(yǎng)陽性率分別80%、80%、100%和80%,停藥2周時,A組與C組真菌培養(yǎng)陰性率均為100%,而B組與D組陰性率分別為45%和50%,真菌涂片也得到類似的結果。3復方制劑的應用殼聚糖是無脊椎甲殼類動物貝殼提取物,是一種高聚合作用的物質。殼聚糖鹽酸鹽為生物高分子材料,具有良好的成膜性,能促進體細胞對營養(yǎng)成分和藥物的吸收。本方選用1%殼聚糖鹽酸鹽為成膜輔料,研制出的新型酮康唑噴膜性能穩(wěn)定,成膜快,膜柔韌、彈性好。酮康唑具有易氧化變色的特性,配制中加熱溶解,影響療效和外觀,加1%吐溫-80起增溶作用,制備中不加熱,使酮康唑穩(wěn)定性好。本實驗采用HPLC法測定新型酮康唑噴膜中酮康唑和醋酸地塞米松的含量。采用乙醇作為溶媒,可充分溶解酮康唑和地塞米松,使提取完全。基質峰保留時間與主藥成分峰保留時間完全分開,基質不干擾本品含量測定。酮康唑受流動相pH影響較大,選用甲醇-磷酸二氫鉀緩沖液(4∶1)為流動相,并調節(jié)pH7.4,使基線平穩(wěn),分離效果良好。該方法操作簡便,精密度高,結果準確可靠。目前,防治濕疹皮炎和皮膚癬菌病的主要劑型有軟膏劑、洗劑、溶液劑等,各劑型作用單一,對同時防治兩類疾病存在一定缺陷。近年研究發(fā)現,濕疹與患者皮膚的微生物攜帶密切相關。Jones等首次報道特應性皮炎(AD)與皮膚癬菌感染的關系,發(fā)現AD患者皮膚癬菌感染率高達41%。而Wilson等發(fā)現,變態(tài)反應性疾病合并皮膚癬菌感染患者抗真菌治療能改善變態(tài)反應性疾病的癥狀,提示濕疹可能也與某些細菌真菌相關。因此,本處方將酮康唑、醋酸地塞米松配伍制成噴膜,能同時起到抗真菌、抗炎、抗過敏止癢作用。藥液短時間內形成一層薄膜,有促進水合作用和溶解角質作用,使藥物透過角質層緩慢釋放,更好地發(fā)揮治療作用。酮康唑為咪唑類廣譜抗真菌藥,對念珠菌屬、糠秕馬拉色菌、球孢子菌、組織胞漿菌、毛癬菌屬、小孢子菌屬和表皮癬菌屬均有較好的抗菌活性,還有抗細菌作用。地塞米松為腎上腺皮質激素類藥,具有抗炎、抗過敏作用,能抑制組胺釋放,抑制炎性因子趨化,抑制變態(tài)反應。兩者合用不僅具有抗炎、抗過敏、止癢作用,又有較強的抗真菌和細菌作用。本實驗結果顯示,新型酮康唑噴膜對豚鼠濕疹模型效果與地塞米松止癢霜效果相當,有效率分別為76%和72%,明顯優(yōu)于空白對照組和基質治療組(P<0.01);對體癬模型療效與復方酮康唑霜一致,有效率均達100%,停藥2周,真菌涂片、培養(yǎng)陰性率達100%,其抗真菌效果明顯優(yōu)于空白對照組和基質治療組(P<0.01)。新型酮康唑噴膜